• Langue : Anglais
• Discipline : Sciences de la vie et de la santé
• Identifiant : 2024ULILS117
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 17/12/2024

Résumé en langue originale

Cette recherche vise à élucider les mécanismes structurels et les caractéristiques de liaison aux glycanes de l'IgM de Mannitou et de son fragment Fab, en se concentrant sur leurs interactions avec les antigènes glucidiques associés aux tumeurs (TACA), tels que le paucimannose. En étudiant le Fab de Mannitou et des constructions tronquées de la grande protéine d'échafaudage AHNAK, cette recherche fournit des informations fondamentales sur les principes moléculaires qui sous-tendent la reconnaissance des glycanes et la spécificité de la liaison dans les interactions entre anticorps.AHNAK, impliquée dans le glioblastome multiforme (GBM) et d'autres cancers, a été utilisée comme modèle pour l'étude des interactions glycanniques. Étant donné qu'il est difficile d'exprimer la protéine AHNAK complète de 5280 acides aminés, des constructions recombinantes tronquées de son domaine central ont été utilisées pour étudier ses propriétés structurelles, ses schémas de glycosylation et sa liaison avec le Fab de Mannitou. Ces constructions présentaient principalement des conformations dépliées ou flexibles ; cependant, un fragment présentait une glycosylation naturelle en paucimannose, conforme à la littérature, ce qui en fait un système modèle précieux pour l'exploration des interactions de liaison avec les glycanes.L'obtention de structures à haute résolution de l'IgM de pleine longueur pose des défis importants en raison de la flexibilité inhérente de ses régions Fab, qui complique la cristallisation et la détermination structurelle. Ces régions peuvent adopter de multiples conformations, ce qui rend difficile l'obtention d'une structure unique et stable. Bien que la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) soit devenue un outil structurel puissant, la flexibilité des Fab de l'IgM limite souvent la résolution, ce qui empêche la visualisation précise des interactions de liaison à l'antigène. Se concentrer sur les fragments Fab isolés de l'IgM pour contourner ces problèmes constitue une solution stratégique. Les fragments Fab, plus stables et mieux définis, permettent une analyse à haute résolution, en contournant la complexité de la structure multivalente de l'IgM. Cette approche facilite l'étude détaillée de la dynamique de liaison et des interactions spécifiques aux Fab, apportant une clarté structurelle essentielle à la compréhension de la base moléculaire des interactions anticorps-antigène.La structure cristalline à haute résolution de la Fab de Mannitou en complexe avec l'heptyl α-D-mannopyranoside a révélé une poche de liaison hydrophobe spécialisée, stabilisée par une liaison cis entre Thr101 et Trp102, facilitant la reconnaissance sélective des glycanes. Les études thermodynamiques indiquent que la configuration monovalente du fragment Fab favorise un mode de liaison déterminé par l'enthalpie, tandis que la structure multivalente de l'IgM complète permet d'améliorer l'affinité de la liaison grâce à un mécanisme coopératif déterminé par l'entropie, ce qui permet des interactions à forte avidité avec une gamme d'antigènes glycaniques.Outre les informations cristallographiques, les analyses SAXS, le dichroïsme circulaire par rayonnement synchrotron (SRCD) et la spectrométrie de masse ont permis de caractériser la glycosylation et la stabilité structurelle du Fab de Mannitou. La glycosylation à l'Asn164 a stabilisé la forme monomérique, réduisant les interactions non spécifiques et empêchant l'agrégation. Des oligomères d'ordre supérieur, en particulier des espèces dimériques, ont été observés en solution, ce qui suggère un potentiel de multimérisation. Alors que le SAXS et la SRCD ont fourni des informations structurelles à basse résolution sur ces formes, la structure à haute résolution de l'état dimérique reste insaisissable en raison d'un manque de modèles appropriés.

Résumé traduit

This research aims to elucidate the structural mechanisms and glycan-binding characteristics of Mannitou IgM and its Fab fragment, focusing on their interactions with tumour-associated carbohydrate antigens (TACAs), such as paucimannose. By studying Mannitou Fab and truncated constructs of the large scaffolding protein AHNAK, this research provides foundational insights into the molecular principles underlying glycan recognition and binding specificity in antibody interactions.AHNAK, involved in glioblastoma multiforme (GBM) and other cancers, was employed as a model for studying glycan interactions. Given the challenge of expressing the full-length 5280-amino acid AHNAK protein, truncated recombinant constructs of its central domain were utilised to investigate its structural properties, glycosylation patterns, and binding with Mannitou Fab. These constructs predominantly exhibited unfolded or flexible conformations; however, one fragment displayed natural paucimannose glycosylation, consistent with the literature, making it a valuable model system for exploring glycan-binding interactions.Obtaining high-resolution structures of full-length IgM poses significant challenges due to the inherent flexibility of its Fab regions, which complicates crystallisation and structural determination. These regions can adopt multiple conformations, making capturing a single, stable structure difficult. Although cryo-electron microscopy (cryo-EM) has advanced as a powerful structural tool, the Fab flexibility in IgM frequently limits resolution, hindering precise visualisation of antigen-binding interactions. Focusing on isolated Fab fragments of IgM to circumvent these issues provides a strategic solution. The Fab fragments, being more stable and defined, allow for high-resolution analysis, bypassing the complexity of IgM's multivalent structure. This approach facilitates the detailed study of Fab-specific binding dynamics and interactions, providing structural clarity essential for understanding the molecular basis of antibody-antigen interactions.The high-resolution crystal structure of Mannitou Fab in complex with heptyl α-D-mannopyranoside revealed a specialised hydrophobic binding pocket stabilised by a non-proline cis-peptide bond between Thr101 and Trp102, facilitating selective glycan recognition. Thermodynamic studies indicate that the Fab fragment's monovalent configuration favours an enthalpy-driven binding mode, while the multivalent structure of full IgM allows for enhanced binding affinity through an entropy-driven, cooperative mechanism, enabling high-avidity interactions with a range of glycan antigens.In addition to crystallographic insights, SAXS, synchrotron radiation circular dichroism (SRCD), and mass spectrometry analyses characterised the glycosylation and structural stability of Mannitou Fab. Glycosylation at Asn164 stabilised the monomeric form, reducing nonspecific interactions and preventing aggregation. Higher-order oligomers, particularly dimeric species, were observed in solution, suggesting potential for multimerisation. While SAXS and SRCD provided low-resolution structural insights into these forms, the high-resolution structure of the dimeric state remains elusive due to a lack of proper models.Collectively, this research highlights the significance of Fab-specific studies in resolving the structural complexities of antibody-antigen binding at high resolution. It contributes to a deeper understanding of the biophysical principles underlying antibody specificity and affinity for carbohydrate antigens.