• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2024ULILR085
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 18/12/2024

Résumé en langue originale

L'horloge circadienne est une fonction biologique qui, tout au long de la journée, fournit à nos organismes une mesure interne du temps. Elle permet ainsi d'orchestrer divers processus physiologiques de manière appropriée, en anticipant les changements quotidiens résultant du cycle jour/nuit. Le bon fonctionnement de cette horloge nécessite une synchronisation constante aux cycles lumière/obscurité et alimentation/jeûne, qui est assurée grâce à des signaux liés à la lumière ambiante et à différents facteurs métaboliques. Les mécanismes impliqués dans la synchronisation de l'horloge par la prise de nourriture demeurent cependant encore mal compris. Afin de répondre à cette question, un modèle mathématique avait été précédemment développé au laboratoire, ce modèle intégrant les senseurs métaboliques AMPK et SIRT1 au réseau moléculaire de l'horloge circadienne.Dans le cadre de cette thèse, je me suis attaché à vérifier expérimentalement l'implication de l'AMPK dans la synchronisation de l'horloge circadienne. Pour répondre à cette question, j'ai utilisé un modèle cellulaire éprouvé, à savoir des cellules U2OS B6 transfectées de manière stable avec un rapporteur circadien pBmal1-luc exprimant une luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de l'horloge Bmal1. En modulant l'activité de l'AMPK par l'administration d'AICAR, un analogue de l'AMP, j'ai mis en évidence que ce dernier augmentait de manière significative et dose-dépendante l'activité du promoteur de Bmal1. Dans le but de quantifier les effets de l'AICAR sur la phase instantanée et la période de l'horloge, j'ai mis en place une procédure de traitement du signal circadien utilisant la transformée de Hilbert pour obtenir ces grandeurs de manière robuste. J'ai ainsi pu montrer que l'administration d'AICAR provoquait un allongement de la période du cycle circadien, et que son effet sur la phase de l'horloge dépend du moment de l'administration. De manière remarquable, ces différents effets dépendent de NAD+, comme nous l'avons montré par l'administration de FK866, un inhibiteur de l'enzyme NAMPT. Ces résultats expérimentaux sont cohérents avec les prédictions du modèle mathématique, ce qui renforce l'hypothèse de départ concernant le rôle d'un axe AMPK-Bmal1 dans la synchronisation de l'horloge circadienne.Nous avons également mis en place une approche de mesures en cellule unique couplant un système de vidéo-microscopie à un dispositif microfluidique. Si le développement de rapporteurs fluorescents du cycle circadien n'a pas abouti à ce jour, l'utilisation d'un biosenseur FRET nous a permis de caractériser précisément la réponse de l'activité de l'AMPK à l'AICAR, et de vérifier que cette activation était significative aux doses employées dans nos études.

Résumé traduit

The circadian clock is a biological function that provides our organisms with an internal measure of time throughout the day. It orchestrates various physiological processes appropriately, anticipating daily changes resulting from the day/night cycle. The proper functioning of this clock requires constant synchronization to light/dark and feeding/fasting cycles, which is ensured by signals related to ambient light and various metabolic factors. However, the mechanisms involved in the synchronization of the clock through food intake remain poorly understood. To address this question, a mathematical model was previously developed in the laboratory, integrating the metabolic sensors AMPK and SIRT1 into the molecular network of the circadian clock.In this thesis, I focused on experimentally verifying the involvement of AMPK in the synchronization of the circadian clock. I used a well-established cellular model, namely stable U2OS B6 cells transfected with a circadian reporter pBmal1-luc expressing a luciferase under the control of the clock gene Bmal1 promoter. By modulating AMPK activity through the administration of AICAR, an AMP analogue, I demonstrated that it significantly and dose-dependently increased the activity of the Bmal1 promoter. In order to quantify the effects of AICAR on the instantaneous phase and period of the clock, I implemented a circadian signal processing procedure using the Hilbert transform to robustly obtain these metrics. I was able to show that the administration of AICAR caused an elongation of the circadian cycle period, and this effect on the clock phase depends on the timing of administration. Remarkably, these different effects depend on NAD+, as we demonstrated through the administration of FK866, an inhibitor of the enzyme NAMPT. These experimental results are consistent with the predictions of the mathematical model, reinforcing the initial hypothesis regarding the role of an AMPK-Bmal1 axis in the synchronization of the circadian clock.We also established a single-cell measurement approach coupling a video microscopy system with a microfluidic device. While the development of fluorescent circadian reporters has not yet been successful, the use of a FRET biosensor allowed us to precisely characterize the response of AMPK activity to AICAR and confirm that this activation was significant at the doses used in our studies.