• Langue : Français
• Discipline : Médecine. Biologie Médicale
• Identifiant : 2012LIL2M344
• Type de thèse : Doctorat de médecine
• Date de soutenance : 20/09/2012

Résumé en langue originale

Contexte : La protéolyse plasmatique du facteur von Willebrand par l’ADAMTS13 est une fonction physiologique primordiale dans la régulation de l’hémostase primaire. Les fragments de protéolyse générés ne sont actuellement mis en évidence que de manière semi-quantitative, ne permettant pas une évaluation fine de la protéolyse. Ce travail a eu pour objectif le développement et l’évaluation d’une méthode ELISA permettant le dosage plasmatique ex-vivo des fragments de protéolyse du facteur von Willebrand (fp-VWF) dans une cohorte de patients avec une maladie de Willebrand constitutionnelle. Matériel & Méthodes : Principe du test : La mise au point de l’ELISA a nécessité l’obtention d’un standard riche en fp-VWF, obtenu par la protéolyse in vitro en conditions dénaturantes d’un concentré plasmatique de VWF (Wilfactin®) par de l’ADAMTS13 d’un pool plasmatique. L’étalonnage est construit par dilutions de ce standard riche en fp-VWF. La spécificité de l’ELISA provient de l’anticorps monoclonal utilisé dans l’étape de capture. Ce dernier reconnaît un épitope adjacent au site de protéolyse, non accessible sur la molécule native. Après l’étape de capture sur une microplaque 96 puits, l’étalonnage et les échantillons sont déposés. Un anticorps polyclonal anti-VWF humain conjugué à la peroxydase est utilisé pour l’étape de révélation. L’ajout du substrat TMB permet ensuite l’obtention d’une coloration dont la DO est lue sur un lecteur de microplaque à 450 nm. Evaluation : Nous avons évalué les performances analytiques intrinsèques du test et son intérêt au sein d’une cohorte de patients du centre de référence de la maladie de Willebrand en comparant les taux de fp-VWF entre un groupe contrôle (n=33) et trois groupes de variants d’intérêt de maladie de Willebrand constitutionnelle: 2A (IIA) (n=36), 2A (IIE) (n=20) et 2B (n=28) Résultats : Le taux de fp-VWF est significativement augmenté dans le groupe 2A (IIA) par rapport aux groupes 2A (IIE) et contrôle (p<0,001). Il existe un effet matrice pour un taux de fp-VWF>25% qui ne nuit pas au caractère discriminant du test. Les autres performances analytiques du test (limites de détection et quantification, répétabilité, fidélité intermédiaire) sont satisfaisantes. Conclusion : Nous avons mis au point un test ELISA permettant le dosage du fp-VWF dans le plasma. Il s’agit du 1er test biologique permettant une évaluation quantitative et ex-vivo du fp-VWF. Une évaluation plus fine de la protéolyse du VWF par l’ADAMTS13 est possible par ce test qui s’avère discriminant entre deux variants de maladie de Willebrand constitutionnelle : le 2A (IIA) et le 2A (IIE). Ce test ouvre des perspectives avec des applications potentielles tant dans le domaine hémorragique (Willebrand acquis et constitutionnel) que thrombotique (purpura thrombotique thrombocytopénique).

Résumé traduit

...