Titre original :

Clonage et caractérisation du promoteur du gène de la nitrate réductase chez Cichorium intybus L. : recherche de facteurs de transcription contrôlant l'expression de la nitrate réductase en fonction de la source azotée

  • Langue : Français
  • Discipline : Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie
  • Identifiant : Inconnu
  • Type de thèse : Doctorat
  • Date de soutenance : 01-01-2000

Résumé en langue originale

La nitrate reductase (nr) des plantes superieures catalyse la reduction du nitrate en nitrite. Afin d'etudier la regulation du gene de la nitrate reductase (nia) chez cichorium intybus, nous avons entrepris l'isolement de son promoteur. Par pcr-inverse, nous avons isole un fragment de 932 pb presentant une homologie de disposition des sequences regulatrices avec les promoteurs de gene nia de vegetaux superieurs. Une analyse de la sequence nucleotidique revele l'existence de sites putatifs de liaison avec des facteurs de transcription de type nit2 de neurospora crassa. Afin de tester la fonctionnalite de cette sequence de 932 pb, nous avons entrepris la transformation de cotyledons etioles de chicoree avec agrobacterium tumefaciens portant la construction pnia : uida. Seule une plante, sur les six descendants de transformants primaires obtenus, montre une induction du promoteur par le nitrate. Cette regulation de la sequence pnia par le nitrate confirme le fait d'avoir clone un promoteur nr fonctionnel. Afin de confirmer ces resultats, nous avons mis au point une technique de detection de l'activite gus dans une culture cellulaire de chicoree transformee transitoirement avec la construction pnia : uida. En effet, la suspension cellulaire de chicoree represente un bon modele d'induction de l'expression de la nr par le nitrate. Lorsque cette suspension est repiquee d'un milieu ammonium a un milieu nitrate, on observe une augmentation tres rapide de l'accumulation de nitrate endogene, puis une augmentation de l'accumulation des transcrits nr et de l'activite nr. Une premiere analyse de la suspension cellulaire de chicoree transformee pnia : uida en condition nitrate et ammonium montre une regulation de l'activite -glucuronidase dependante du nitrate. Dans une derniere partie, nous avons tente de mettre en evidence des proteines impliquees dans la reponse a l'induction par le nitrate dans la suspension cellulaire. Au niveau des proteines tissulaires solubles, tres peu de differences sont notees. Par contre, les differences sont plus marquees au niveau des proteines nucleaires, tant au niveau de la presence des proteines que de leur accumulation. 5 proteines montrant des differences d'accumulation en fonction de la source d'azote ont ete prelevees afin de realiser un spectre de masse. La proteine 2 presente de fortes homologies avec la proteine narq d'escherichia coli. Narq est impliquee dans la reponse au facteur nitrate en activant les genes narp et narl. Cependant, une micro-sequence de la proteine 2 n'est retrouvee dans aucune proteine isolee jusqu'a ce jour. Enfin, par des experiences de retards sur gels, nous montrons que certaines proteines nucleaires pourraient se lier specifiquement au promoteur nia de chicoree en presence de nitrate dans la region 391 a 536.

  • Directeur(s) de thèse : Rambour, Serge

AUTEUR

  • Têtu, Jean-François
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