• Langue : Français
• Discipline : Biochimie
• Identifiant : Inconnu
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 01/01/2003

Résumé en langue originale

Les modifications post-traductionnelles covalentes des protéines sont des facteurs essentiels de la modulation de leur activité biologique. Leur nature ainsi que leur représentation peuvent être profondément affectées lors d'apparition de pathologies telles que le cancer. Ainsi dans les cas des mucines, les structures O-glycanniques apparaissent-elles en général plus courtes et peuvent constituer des structures antigéniques. Afin d'identifier les différentes glycosyl-transférases impliquées dans l'élaboration de ces structures ainsi que leurs spécificités de transfert vis-à-vis des squelettes peptidiques, des peptidiques synthétiques correspondant aux séquences répétitives de ces mucines sont incubés en présence de différentes glycosyl-transférases. La localisation des sites de glycosylation apparaît alors ardue, car contrairement aux sites de N-glycosylations, il n'existe pas d'enzyme permettant une libération qualitative et quantitative des structures O-glycanniques. Celles-ci sont donc habituellement libérées par la soude en milieu réducteur qui ne permet pas de conserver l'intégrité de la chaîne peptidique pourtant indispensable au positionnement de ces O-glycannes. Aussi avons-nous optimisé différentes approches de bêta-élimination / addition surmontant cette difficulté. Une étude exhaustive de différentes amines nous a permis de définir la diméthylamine comme un bon candidat à une bêta-élimination conservant l'intégrité des séquences peptidiques correspondant aux motifs répétés des mucines de type MUC5AC. Cette bêta-élimination / addition passe par la formation d'anhydro-acides aminés (action de la diméthylamine) et la fixation covalente sur ces substrats réactifs d'une étiquette chimique stable (action de l'éthanethiol ou du propanethiol). Le positionnement des acides aminés Sérine/Thréonine initialement glycosylés est alors réalisé par spectrométrie de masse en tandem. Une dérivation préalable de l'extrémité amino-terminale par une charge permanente apportée par un cation phosphonium est apparue indispensable au séquençage de ces peptides particulièrement riches en acides aminés hydroxylés. En effet, la dissociation des précurseurs protonés se traduit pour une large part par la perte d'H2O ou de CH3CHO (acétaldéhyde). Les spectres ne comportent pas de séries complètes d'ions y et/ou b indispensables à la localisation des acides aminés initialement glycosylés, la dérivation apparaissant dès lors essentielle. Par ailleurs, une étude des comportements dissociatifs des précurseurs MH+, M2H2+, C+ et CH2+ démontre le rôle catalytique d'un proton « mobile » dans la fragmentation prédominante des glycopeptides au niveau de la liaison glycanne-sérine/thréonine. Une étude par spectrométrie de masse en tandem des précurseurs deutérés permet en outre de démontrer l'implication d'un proton non-échangeable dans le mécanisme de rupture. Il ressort de cette étude que le séquençage et la localisation des structures O-glycopeptidiques peuvent être envisagés de manière hautement prédictive et sans ambiguïté par l'analyse des spectres de dissociation des ions précurseurs monochargés cationisés à l'aide d'une charge permanente. Une illustration en est donnée par le séquençage et la localisation de l'ensemble des sites O-glycosylés de glycopeptides de type MUC5AC réalisés pas spectrométrie de masse MALDI-PSD-TOF.