• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Microbiologie
• Identifiant : 2026ULILS008
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 25/03/2026

Résumé en langue originale

Le cuivre est un élément essentiel à la survie des bactéries, car il est retrouvé notamment dans le site actif de plusieurs enzymes clés. Toutefois, lorsqu'il est présent en excès, il devient hautement toxique. Les bactéries doivent donc maintenir un équilibre fin entre l'acquisition de cuivre et la protection contre sa toxicité. Alors que les mécanismes de défense contre le cuivre sont relativement bien caractérisés, les systèmes d'importation restent encore peu connus. Cette thèse a permis de caractériser un nouveau système d'acquisition du cuivre chez l'agent de la coqueluche, Bordetella pertussis. Il s'agit d'un transporteur TonB-dépendant (TBDT), nommé CrtABp (anciennement BfrG). Nos expériences in vitro montrent que CrtABp importe le Cu(II) complexé à un ligand possédant des groupements carboxylates. Le cuivre importé via CrtABp est destiné aux cytochromes oxydases à hème-cuivre (HCOs). Par analyses de similarité de séquence, nous avons pu définir la sous-famille CrtA de TBDTs. Le lien de ces protéines avec la respiration semble être conservé dans d'autres espèces. Le(s) ligand(s) naturel(s) reste(nt) à identifier. Nos données indiquent que CrtABp n'est probablement pas strictement spécifique d'un seul ligand mais pourrait agir comme transporteur ‘opportuniste'. Ce mode de fonctionnement pourrait être lié aux propriétés chimiques du cuivre, qui possède une forte affinité pour de nombreux composés organiques. La structure de CrtABp a été résolue et le site de fixation du complexe cuivre-ligand a été localisé, révélant le rôle essentiel d'une histidine dans le transport. Le lien entre ce système d'acquisition du cuivre et la respiration via les HCOs a été confirmé en étudiant CrpH, la protéine codée par le dernier gène de l'opéron qui inclut aussi crtA. CrpH est une protéine de la membrane interne de la famille PepSY_TM, dont les membres connus sont des réductases de Fe(III) en Fe(II). Nos résultats montrent que, chez B. pertussis, les HCOs sont particulièrement importantes en conditions de faible aération, contrairement à CydAB, la cytochrome bd ubiquinol oxydase indépendante du cuivre, qui est nécessaire surtout en forte aération. L'inactivation de crpH cause un important défaut de croissance de B. pertussis en faible aération, associé à une diminution notable du niveau intracellulaire d'ATP, indiquant un dysfonctionnement respiratoire. Cette hypothèse est confortée par l'analyse transcriptomique du mutant. En revanche, en forte aération, le mutant se comporte comme la souche sauvage, notamment grâce à l'activité de CydAB. L'effet de la substitution de résidus His conservés sur la croissance de B. pertussis indique que CrpH coordonnerait au moins un hème indispensable à son activité, comme les autres enzymes de la famille PepSY_TM. Par analogie avec ces derniers, CrpH pourrait agir comme réductase de Cu(II) en Cu(I), en vue de son insertion dans le site actif d'une ou des deux HCOs de B. pertussis. Cette hypothèse est appuyée par une redondance fonctionnelle partielle entre CrpH et CcoG, une réductase de cuivre impliquée dans l'assemblage de la cytochrome c oxydase de type cbb3 chez d'autres bactéries. Enfin, des expériences d'infection chez la souris montrent que CrtABp et CrpH sont toutes deux importantes pour la compétitivité de B. pertussis in vivo.

Résumé traduit

Copper is an essential element for bacterial fitness, as it is found in the active site of several key enzymes. However, when present in excess, it becomes highly toxic. Bacteria must therefore maintain a delicate balance between copper acquisition and protection against copper-induced toxicity. While copper detoxification mechanisms are relatively well characterized, import systems remain poorly understood. This work has led to the characterization of a new copper-acquisition system in the whooping cough agent Bordetella pertussis. It consists in a TonB-dependent transporter (TBDT), named CrtABp (formerly BfrG). In vitro experiments show that CrtABp imports Cu(II) complexed with a ligand containing carboxylate groups. The copper imported via CrtABp is destined for the heme-copper oxidases (HCOs) of B. pertussis. Sequence-similarity analyses identified the CrtA subfamily of TBDTs. In silico analyses indicated that the link with respiration appears to be conserved in other species. The native ligand remains to be identified, but current data indicate that CrtABp might not be strictly specific to a single ligand but might function as a promiscuous transporter. This feature is presumably related to the chemical properties of copper, which exhibits high affinity for numerous organic compounds. The structure of CrtABp was solved, identifying a conserved binding site of the copper-ligand complex that includes an invariant histidine residue with an essential role in transport. The link between this copper-acquisition system and respiration via HCOs was confirmed by investigating CrpH, the protein encoded by the last gene of the operon also encoding CrtABp. CrpH is an inner-membrane protein belonging to the PepSY_TM family, whose known members are reductases of Fe(III) to Fe(II). Our results show that, in B. pertussis, HCOs are particularly important under low-aeration conditions, whereas CydAB, the copper-independent cytochrome bd ubiquinol oxidase, plays a predominant role under high aeration. The crpH mutant displays a marked growth defect under low aeration, associated with a reduction in intracellular ATP levels, indicating impaired respiratory function. This hypothesis is further supported by the transcriptomic profile of the mutant. Under high aeration, however, the mutant behaves like its parent, owing to the activity of the CydAB complex. The effect of substituting conserved His residues of CrpH suggests that it coordinates a heme group essential for its activity, similar to other PEPSY_TM enzymes. By analogy with the latter proteins, CrpH might act as a Cu(II) to Cu(I) reductase, thereby facilitating copper insertion into the active site of one or both HCOs of B. pertussis. This hypothesis is supported by partial functional redundancy between CrpH and CcoG, a copper reductase involved in the assembly of the cbb3-type cytochrome c oxidase in other bacterial species. Finally, mouse infection experiments showed that both CrtABp and CrpH are important for the in vivo competitiveness of B. pertussis.