• Langue : Français
• Discipline : Chimie organique, minérale, industrielle
• Identifiant : 2024ULILS113
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 11/12/2024

Résumé en langue originale

Les glycanes sont constitués de chaînes complexes de monosaccharides, généralement liées à d'autres biomolécules. Ces glycoconjugués jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques allant de la reconnaissance cellulaire à la modulation de la réponse immunitaire. Bien qu'il soit crucial de comprendre les mécanismes qui régissent leur participation à diverses pathologies, il est cependant plus difficile d'étudier les glycanes que, par exemple, les protéines - en particulier en bioimagerie. En effet, les méthodes de marquage spécifiques aux glycanes sont moins répandues. De plus, les limitations de la microscopie optique classique, notamment en résolution spatiale (200-250 nm), freinent les études visant à comprendre leur biosynthèse et leur trafic intracellulaire. Si les microscopies de super-résolution en fluorescence ont permis de lever ces barrières, ces techniques nécessitent un équipement hautement spécialisé, couteux, et peu accessible dans la plupart des laboratoires. Cette thèse vise à développer des approches méthodologiques permettant d'observer les glycoconjugués à l'échelle nanoscopique facilement, en utilisant des microscopes de routine. Pour cela, nous avons souhaité combiner la stratégie du rapporteur chimique bioorthogonal et la microscopie d'expansion.La stratégie du rapporteur chimique (SRC) permet d'observer des biomolécules d'intérêt, ici les glycoconjugués, directement dans les cellules en intégrant des rapporteurs chimiques synthétiques par marquage métabolique, puis en liant une sonde moléculaire aux rapporteurs métabolisés par chimie bioorthogonale. Pour notre étude, nous nous sommes principalement intéressés à la ! comme modèle, ce type de glycosylation étant impliqué dans de nombreuses pathologies (cancers, infections bactériennes ou virales, maladies génétiques). A l'instar des méthodes d'ingénierie métabolique existantes focalisées sur les marquages de surface cellulaire, l'utilisation de la chimie click bioorthogonale associée à l'incorporation métabolique de monosaccharides modifiés portant une fonction azoture nous a ainsi permis de visualiser les sialoglycoconjugués intracellulaires dans divers modèles, en présence ou non de co-marquages par immunofluorescence. Cette méthode SRC a ensuite été transposée à la microscopie d'expansion (ExM), une technique super-résolutive ayant l'avantage d'être compatible avec tout équipement de microscopie en fluorescence. L'ExM consiste en l'augmentation physique de la taille de l'échantillon à l'aide d'un hydrogel gonflable, permettant d'atteindre des résolutions allant jusqu'à 70 nm. En examinant les conditions d'ancrage moléculaire possibles des glycoconjugués à l'hydrogel et en modulant les conditions de digestion, nous avons pu optimiser cette méthode pour l'étude des acides sialiques. L'alliance de l'ExM et de la SRC nous a ainsi permis de visualiser les sialoglycoconjugués intracellulaires à haute résolution, dans divers contextes physiologiques, en utilisant un protocole simple et un microscope confocal, confirmant l'ExM comme outil puissant pour l'analyse des glycoconjugués dans un contexte de pathologie. Cette thèse envisage également des innovations technologiques prometteuses pour l'ExM, en proposant une approche de photolithographie permettant de suivre la même cellule avant et après expansion, ou de microfluidique pour permettre de miniaturiser et d'exploiter ce protocole sur plusieurs conditions en parallèle.

Résumé traduit

Glycans consist of complex chains of monosaccharides, usually linked to other biomolecules. These glycoconjugates play an essential role in many biological processes, ranging from cell recognition to the modulation of the immune response. Although it is crucial to understand the mechanisms that regulate their involvement in various pathologies, studying glycans is more challenging than, for example, proteins—especially in bioimaging. Specific glycan labeling methods are less widespread, and the limitations of classical optical microscopy, particularly in terms of spatial resolution (200-250 nm), hinder studies aiming to understand their biosynthesis and intracellular trafficking. While super-resolution fluorescence microscopies have overcome these barriers, these techniques require highly specialized, expensive equipment that is not easily accessible in most laboratories. This thesis aims to develop methodological approaches to observe glycoconjugates at the nanoscale using standard microscopy equipment. To achieve this, we sought to combine the bioorthogonal chemical reporter strategy with expansion microscopy.The chemical reporter strategy (CRS) allows the observation of biomolecules of interest, here glycoconjugates, directly within cells by integrating synthetic chemical reporters through metabolic labeling and then linking a molecular probe to the metabolized reporters via bioorthogonal chemistry. For our study, we focused mainly on sialylation as a model, as this type of glycosylation is involved in many pathologies (cancers, bacterial or viral infections, genetic diseases). Similar to existing metabolic engineering methods focused on cell surface labeling, the use of bioorthogonal click chemistry associated with the metabolic incorporation of modified monosaccharides carrying an azide function enabled us to visualize intracellular sialoglycoconjugates in various models, with or without co-labeling via immunofluorescence. This CRS method was then applied to expansion microscopy (ExM), a super-resolution technique that is compatible with any fluorescence microscopy equipment. ExM consists of physically enlarging the sample using a swellable hydrogel, allowing resolutions down to 70 nm. By examining possible molecular anchoring conditions of glycoconjugates to the hydrogel and modulating digestion conditions, we were able to optimize this method for the study of sialic acids. The combination of ExM and CRS allowed us to visualize intracellular sialoglycoconjugates at high resolution in various physiological contexts using a simple protocol and a confocal microscope, confirming ExM as a powerful tool for glycoconjugate analysis in pathology. This thesis also considers promising technological innovations for ExM, proposing a photolithography approach to track the same cell before and after expansion, or microfluidics to miniaturize and apply this protocol across multiple conditions in parallel.