• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2024ULILS109
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 02/12/2024

Résumé en langue originale

L'amidon est un polymère de glucose synthétisé par les plantes chez lesquelles il représente la principale forme de stockage d'énergie. Il est localisé dans les plastes sous forme de grains insolubles. L'amidon est composé principalement de deux polyglucanes, l'amylose, formé de chaines linéaires et l'amylopectine, plus ramifiée, s'assemblent pour former le grain semi-cristallin. La synthèse de l'amidon implique l'action coordonnée de plusieurs enzymes, notamment les amidon synthases (SS), les enzymes de branchement (BE) et de débranchement (DBE). Parmi ces enzymes, la SS4 joue un rôle primordial dans l'initiation de la synthèse de l'amidon. SS4 est responsable de la régulation du nombre de grains d'amidon et de leur forme dans les chloroplastes. Chez Arabidopsis thaliana, les plantes mutantes dépourvues de SS4 produisent moins de grains par chloroplaste, et ces derniers sont plus gros et ronds par rapport aux grains lenticulaires observés chez les plantes sauvages.Dans la plante, SS4 interagit avec d'autres protéines, non enzymatiques pour former un complexe d'initiation. Parmi celles-ci, PII1 a été décrite comme impliquée également dans l'initiation. Les mutants dépourvus de PII1 présentent un phénotype similaire à celui des mutants SS4, avec un seul gros granule lenticulaire par chloroplaste, bien que ce phénotype soit moins sévère que celui des mutants SS4, qui présentent des chloroplastes vides. Ces résultats suggèrent que PII1 est importante pour une initiation normale de la synthèse des grains d'amidon. PII1 fait partie du complexe d'initiation comprenant SS4, PTST2, PTST3, MFP1 et SS5. Toutes ces protéines contiennent des régions coiled-coils prédites suggérant des interactions protéine/protéine. PII1 ne possède ni activité catalytique ni domaine de fixation aux glucanes, ce qui suggère un rôle plutôt mécanique ou de régulation et probablement une implication dans l'initiation à travers l'interaction qu'elle forme avec SS4, PTST2 et SS5. Il a été proposé que PII1 agisse spécifiquement sur la capacité de SS4 à contrôler le nombre d'évènements d'initiation de l'amidon et pourrait modifier sa conformation ou plus largement modifier la stabilité d'un complexe protéique incluant SS4 et d'autres facteurs du complexe d'initiation.Ce projet de recherche vise à caractériser la fonction moléculaire et fonctionnelle de PII1 et de SS4 en utilisant des approches structurales biophysiques et biochimiques. L'objectif plus global est d'avancer dans la compréhension du mécanisme d'initiation de la biosynthèse de l'amidon. Les protéines PII1 et SS4 ont été exprimées chez E.coli. Des constructions tronquées ont été synthétisées afin de faciliter la purification et utilisées pour les études d'activités enzymatiques et analyses biophysiques, dont le dichroïsme circulaire. En parallèle, des analyses bio-informatiques ont été menées pour modéliser la structure des protéines seules et en complexe. Les résultats obtenus ont permis de décrire la structure de PII1 et de montrer qu'elle est capable d'inhiber l'activité synthase de SS4 et d'avancer dans la compréhension de son rôle dans les mécanismes moléculaires de l'initiation de la biosynthèse de l'amidon chez la plante.

Résumé traduit

Starch is a glucose polymer synthesised by plants, in which it is the main form of energy storage. It is found in the plastids in the form of insoluble granules. Starch is mainly composed of two polyglucans, amylose, which is made up of linear chains, and amylopectin, which is more branched, which combine to form the semicrystalline grain. Starch synthesis involves the coordinated action of several enzymes, in particular starch synthases (SS), branching enzymes (BE) and debranching enzymes (DBE). Among these enzymes, SS4 plays a key role in initiating starch synthesis. SS4 is responsible for regulating the number and shape of starch granules in chloroplasts. In Arabidopsis thaliana, mutant plants lacking SS4 produce fewer grains per chloroplast, which are larger and rounder than the lenticular grains observed in wild-type plants.In plants, SS4 interacts with other non-enzymatic proteins to form an initiation complex. Among these, PII1 has been described to be involved in initiation. Mutants lacking PII1 show a phenotype similar to that of SS4 mutants, with a single large lenticular granule per chloroplast, although this phenotype is less severe than that of SS4 mutants, which show empty chloroplasts. These results suggest that PII1 is important for the normal initiation of starch granule synthesis. PII1 is part of the initiation complex that includes SS4, PTST2, PTST3, MFP1 and SS5. All these proteins contain predicted coiled-coil regions suggesting protein-protein interactions. PII1 has neither catalytic activity nor a glucan-binding domain, suggesting a mechanical or regulatory role and probably an involvement in initiation through the interaction it forms with SS4, PTST2 and SS5. It has been proposed that PII1 acts specifically on the ability of SS4 to control the number of starch initiation events and could alter its conformation or, more broadly, the stability of a protein complex including SS4 and other factors in the initiation complex.This research project aims to characterise the molecular and functional function of PII1 and SS4 using biophysical and biochemical structural approaches. The overall aim is to improve our understanding of the initiation mechanism of starch biosynthesis. PII1 and SS4 proteins were expressed in E. coli. Truncated constructs were synthesised to facilitate purification and used for enzymatic activity studies and biophysical analyses, including circular dichroism. In parallel, bioinformatics analyses were carried out to model the structure of the proteins alone and in complex. The results obtained have enabled us to describe the structure of PII1 and to show that it is capable of inhibiting the synthase activity of SS4, thereby advancing our understanding of its role in the molecular mechanisms involved in the initiation of starch biosynthesis in plants.