• Langue : Français
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2024ULILS103
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 27/06/2024

Résumé en langue originale

La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle (MPT) régulée par deux enzymes antagonistes, l'OGT (O-GlcNAc transférase), qui transfère le résidu GlcNAc à partir de l'UDP-GlcNAc sur le groupe hydroxyle d'une sérine ou d'une thréonine des protéines cibles, et l'OGA (O-GlcNAcase) qui hydrolyse ce résidu. Cette MPT est étroitement liée à la voie de biosynthèse des hexosamines qui produit l'UDP-GlcNAc et fait intervenir différents nutriments tels que le glucose ou autres monosaccharides, les acides gras, l'UTP et l'ensemble des acides aminés, la glutamine en particulier. L'émergence de certaines pathologies, notamment le cancer, est associée à une O-GlcNAcylation aberrante. En ce sens, les travaux antérieurs de l'équipe ont indiqué une augmentation des niveaux d'expression de la β-caténine O-GlcNAcylée dans les cancers épithéliaux. Quatre sites de O-GlcNAcylation ont été identifiés au niveau de l'extrémité N-terminale de la β-caténine (S23/T40/T41/T112). La T41 revêt un intérêt particulier car elle influence la sensibilité au protéasome de la β-caténine selon qu'elle soit O-GlcNAcylée ou phosphorylée, les deux MPTs antagonistes jouant des fonctions opposées sur l'expression de la protéine. Cependant, il était difficile voire impossible de suivre spécifiquement cette protéine sous sa forme O-GlcNAcylée ou phosphorylée dans la même cellule. Pour pallier cette lacune, nous avons combiné la technologie d'expansion du code génétique avec la chimie click pour suivre la O-GlcNAcylation de la T41 en utilisant une S-GlcNAc, un analogue enzymatiquement stable de la O-GlcNAc. Une forme non modifiée en T41 ainsi qu'une forme phosphomimétique (T41E) de la β-caténine ont été générées. Nous avons synthétisé un ensemble de cassettes d'expression β-caténine-XFP (fusionnées ou non à un TAT-HA) et introduit le codon ambre TAG à la position T41 par mutagenèse dirigée du site pour produire la forme S-GlcNAcylée. Chaque forme (wt, T41S-GlcNAc et T41E) présentant une fluorescence spécifique a été produite chez E. coli, purifiée puis introduite en cellule humaine par transduction cellulaire ou par lipofection. Nos résultats indiquent que selon l'isoforme, les protéines n'occupent pas exactement le même espace dans la cellule, aucune superposition totale n'ayant été observée. La forme S-GlcNAcylée de la β-caténine en T41 semble plus stable dans le temps que la forme phosphomimétique, renforçant le rôle protecteur de la O-GlcNAcylation de la β-caténine vis-à-vis de la dégradation au contraire de sa phosphorylation.La technologie que nous avons développée doit permettre de fabriquer à façon des protéines modifiées par des groupements chimiques différents sur des sites bien précis, et d'en étudier l'impact sur le comportement de la protéine en réponse à divers stimuli.

Résumé traduit

O-GlcNAcylation is a post-translational modification (PTM) regulated by two antagonistic enzymes, OGT (O-GlcNAc transferase), which transfers the GlcNAc residue from UDP-GlcNAc to the hydroxyl group of a serine or a threonine of target proteins, and OGA (O-GlcNAcase) which hydrolyzes this residue. This PTM is closely linked to the hexosamine biosynthesis pathway that produces UDP-GlcNAc by using different nutrients such as glucose or other monosaccharides, fatty acids, UTP and all amino acids, glutamine in particular. The emergence of certain pathologies, cancer in particular, is associated with aberrant O-GlcNAcylation. In this sense, the previous work of the team showed an increase in the expression levels of O-GlcNAcylated β-catenin in epithelial cancers. Four O-GlcNAcylation sites were identified at the N-terminus of β-catenin (S23/T40/T41/T112). T41 is of particular interest because it influences the proteasome sensitivity of β-catenin depending on whether it is O-GlcNAcylated or phosphorylated, the two antagonistic PTMs playing opposite functions on the expression of the protein. However, it was difficult or impossible to specifically track this protein in its O-GlcNAcylated or phosphorylated form in the same cell. To fill this gap, we combined genetic code expansion technology with click chemistry to monitor O-GlcNAcylation of T41 using S-GlcNAc, an enzymatically stable analogue of O-GlcNAc. An unmodified form at T41 as well as a phosphomimetic form (T41E) of β-catenin were generated. We synthesized a set of β-catenin-XFP expression cassettes (fused or not to a TAT-HA) and introduced the amber TAG codon at position T41 by site-directed mutagenesis to produce the S-GlcNAcylated form. Each form (wt, T41S-GlcNAc and T41E) presenting a specific fluorescence was produced in E. coli, purified and then introduced into human cells by cell transduction or by lipofection. Our results indicate that depending on the isoform, the proteins do not occupy exactly the same space in the cell, no total overlap having been observed. The S-GlcNAcylated form of β-catenin at T41 seems more stable over time than the phosphomimetic form, reinforcing the protective role of O-GlcNAcylation of β-catenin against degradation as opposed to its phosphorylation.The technology that we have developed should make it possible to custom manufacture proteins modified by different chemical groups on specific sites, and to study their impact on the behavior of the protein in response to various stimuli.