• Langue : Anglais
• Discipline : Sciences de la vie et de la santé
• Identifiant : 2024ULILS084
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 19/12/2024

Résumé en langue originale

Le norovirus, un virus non-enveloppé à ARN simple brin positif (+) de la famille des Caliciviridae est très contagieux et résistant. Un important effort de recherche est mené pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse norovirale. Le système immunitaire inné est principalement activé lors des infections à norovirus. L'ubiquitination est un processus post-traductionnel ATP-dépendant, qui régule de nombreuses étapes de cette réponse immunitaire en catalysant l’ajout de différents types de chaînes de polyubiquitine sur certains résidus lysine de protéines cibles de manière à réguler leur sort.Il est à noter que des niveaux accrus de polyubiquitination peuvent être mesurés dans des cultures de macrophages après infection avec la souche de norovirus murin S99 (MNoV_S99). Dans une première étude, nous avons évalué comment l'altération de la formation des chaînes de polyubiquitine pouvait affecter le cycle de vie de MNoV_S99. En utilisant la lignée cellulaire de macrophage Raw264.7, plusieurs lignées cellulaires stables ont été générées en surexprimant les constructions YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48R ou_K63R. Toutes les constructions non-WT codent une protéine de fusion d'ubiquitine dont une lysine a été mutée en un résidu arginine, empêchant ainsi la formation des chaînes de polyubiquitine correspondantes. Une expression significativement réduite de plusieurs marqueurs viraux ainsi qu’une diminution significative des titres viraux a pu être mesurée seulement dans les cellules K48R. Cette régulation négative n’était pas liée à une entrée virale perturbée, mais plutôt par une hypersécrétion constitutive de la cytokine pro-inflammatoire TNF générant ainsi un environnement hostile à la propagation du MNoV_S99. L’ajout de chaînes de polyubiquitine K48 sur un substrat entraîne généralement celui-ci vers la dégradation protéasomale. Nos données sont les premières à suggérer que le MNoV_S99 bénéficie de la régulation à la baisse d’un ou plusieurs composants cytosoliques anti-viraux, encore non identifiés, vraisemblablement sensibles à la dégradation protéasomale. Les E3-ubiquitine ligases jouent un rôle central dans le processus d'ubiquitination en sélectionnant les substrats à ubiquitiner. Il a été démontré que SMURF1, une ubiquitine ligase à domaine HECT, atténue la demi-vie de plusieurs agents pathogènes par le biais de l'ubiquitination K48.Dans la seconde étude présentée dans ce manuscrit, nous avons analysé le rôle joué par SMURF1 dans la propagation du MNoV_S99. Tout d’abord, nous avons identifié l’interaction de SMURF1 avec la principale protéine de capside norovirale VP1. Mais cette interaction n'est pas associée à l'ubiquitination de la capside virale, ce qui suggère que le virus lui-même n'est pas ciblé par la dégradation protéasomale. En effet, lorsque des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), de souris, où Smurf1 est inactivé par rapport à des souris sauvages, ont été infectés par le MNoV_S99, nous avons mesuré une diminution significative de l'expression de plusieurs marqueurs viraux. De même, les titres viraux dans les cultures Smurf1-/-étaient significativement inférieurs à ceux des BMDM WT. Ceci suggère un rôle bénéfique de SMURF1 et de l'ubiquitination K48-dépendante dans le cycle de vie des norovirus. Ceci a été confirmé par le fait que les BMDM WT traités avec l'inhibiteur de protéasome MG132 ont montré une production de MNoV_S99 significativement réduite.Dans l'ensemble, nos données permettent de mettre en lumière un rôle bénéfique de l'activité protéasomale dans le maintien d'un environnement permissif dans la propagation de la souche S99 du norovirus murin.

Résumé traduit

The Norovirus, a small non-enveloped single stranded positive-sense RNA virus, that belongs to the Caliciviridae family, is highly contagious and resistant and is a major causal agent of viral gastroenteritis resulting in a high human and socioeconomic cost. Due to a lack of approved therapy options, intensive research effort is on going to better understand the mechanisms of noroviral pathogenesis.Viral entry is known to trigger signals that activate the innate immune system in order to neutralize the pathogen. Ubiquitination is an ATP-dependent multistep posttranslational process, involved in the regulation of the immune response, in which a ubiquitin moiety is added to a substrate. Interestingly, we have measured increased levels of polyubiquitination following mouse norovirus (MNoV) infection in macrophages. Different types of polyubiquitin chains can be formed on a given target’s lysine residue which determines the fate of those proteins. In a first study we have evaluated how the alteration of polyubiquitin chain formation could affect the noroviral life cycle. Using the macrophage cell line Raw264.7, several stable cell lines were generated by overexpressing YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48Ror_K63R constructs. All non-WT constructs encode a ubiquitin fusion protein with one lysine mutated into an arginine residue, thus preventing the formation of their respective polyubiquitin chains. Upon infection with the murine norovirus S99 (MNoV_S99) strain, we measured a significantly reduced expression of the viral markers VP1, NS5 and double-stranded RNA in cells where the formation of polyubiquitin chains via lysine 48 was abrogated. The TCID50 titration method further confirmed the drop of norovirus production in these cells. This negative regulation could not be explained by perturbed viral entry, however, a constitutive hypersecretion of the pro-inflammatory cytokine TNF and downstream upregulation of IκBαphosphorylation followed by NF-κB nuclear translocation was found which could potentially impose a non-permissive environment for MNoV_S99 replication and propagation.Additionally, since K48-polyubiquitin chain formation is well described to target proteins toward proteasomal degradation, our data are the first to suggest that the MNoV_S99benefits from the down regulation of unidentified cytosolic component(s) that are cleared via the proteasome.E3-ubiquitin ligases play a central role in the ubiquitination process by selecting which substrates go through ubiquitination. SMURF1, a HECT domain ubiquitin ligase, wasshown to mitigate, via K48-ubiquitination, the half-life of several pathogens. In the second study presented in this manuscript, we have investigated the role played bySMURF1 in MNoV_S99 propagation. Interestingly, we have identified that SMURF1 can bind to the main noroviral capsid protein Vp1. But this interaction was not associated with ubiquitination of the viral capsid, suggesting that the virus itself is not targeted towards proteasomal degradation. Indeed, when bone marrow derived macrophages (BMDM), established from Smurf1 knock-out mice in comparison with WT mice, were infected with MNoV_S99 we measured significantly decreased expression of several viral markers. Similarly, viral titres in Smurf1-/- cultures were significantly lower than WT BMDMs. This hints at a beneficial role of SMURF1 and K48-dependent ubiquitination in the noroviral lifecycle. This was further confirmed when WT BMDMs treated with the proteasome inhibitor MG132 showed significantly reduced MNoV_S99 production.Taken together, our data shed light on a beneficial role of the proteasomal activity in maintaining a permissive environment for the propagation of the S99 mouse norovirus strain.