• Langue : Français
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2024ULILS001
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 05/01/2024

Résumé en langue originale

La coqueluche, causée par la bactérie B. pertussis, est une maladie respiratoire responsable de plus de 19,5 millions de cas dans le monde et de plus de 117 000 décès par an, principalement parmi les jeunes enfants. Suite à l'infection, B. pertussis va progresser au sein du tractus respiratoire et rencontrer les macrophages alvéolaires (MAs) qui constituent la population immunitaire innée majeure des alvéoles. Ces cellules sentinelles jouent un rôle clé dans l'élimination de la bactérie. Néanmoins, il a été montré que B. pertussis est capable de moduler la réponse de ces cellules afin d'échapper à la dégradation. De plus, B. pertussis peut persister à l'intérieur des macrophages pendant plusieurs jours, suggérant que ces cellules pourraient constituer un réservoir pour la bactérie. Afin de comprendre l'origine de cette persistance, il est nécessaire de caractériser les voies de dégradation mises en jeu par les MAs lors de l'infection. Cependant l'étude de l'interaction de B. pertussis avec les MAs est complexe car les modèles cellulaires tels que les cellules Thp-1 ou les cellules Raw 264.7 sont phénotypiquement éloignés des MAs. De plus, l'extraction de MAs murins primaires nécessite l'utilisation de nombreux animaux.Dans ce travail, j'ai évalué l'intérêt des cellules MPI comme modèle d'étude de l'interaction de B. pertussis avec les MAs. Les MPI sont des cellules murines issues de foie fœtal qui, en présence de GM-CSF, prolifèrent et présentent des fonctionnalités similaires aux macrophages alvéolaires. Après avoir défini les conditions optimales d'infection, j'ai montré que les bactéries sont internalisées par les cellules MPI puis rapidement dégradées. Cette clairance bactérienne est associée à l'induction d'une réponse pro-inflammatoire similaire à celle observée lors d'une infection de MAs primaires murins par B. pertussis. De façon intéressante, cette augmentation de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires est associée à une diminution de l'activation des facteurs transcriptionnels STAT3 et STAT5 chez les cellules MPI infectées.Le modèle MPI ainsi caractérisé a été utilisé pour étudier les mécanismes de dégradation intracellulaire mis en jeu par les MAs lors d'une infection par B. pertussis. Il a été montré que B. pertussis est capable d'échapper à la phagocytose, ce qui implique pour les macrophages la nécessité d'induire d'autres voies de dégradation pour éliminer la bactérie. Lors d'infection avec M. tuberculosis et S. pneumoniae, l'implication des voies de l'autophagie et de la phagocytose associée à LC3 (LAP) dans la clairance du pathogène a été établie mais le rôle de ces processus dans la pathogénèse de B. pertussis n'a pour le moment jamais été décrit.Au cours de ce travail, j'ai montré que l'infection par B. pertussis induit l'augmentation de l'expression de la protéine LC3 et l'accumulation de la forme lipidée LC3-II, marqueur clé des mécanismes d'autophagie et de LAP. L'induction d'autres protéines impliquées spécifiquement dans l'autophagie telles que p62 et ATG5 a également été observée. Parallèlement, une diminution de l'activation de mTOR et de l'expression de Rubicon, qui constituent deux régulateurs négatifs de l'autophagie a été détectée. Enfin, suite à l'infection des MPI par B. pertussis, nous avons observé par microscopie électronique à transmission la formation de vésicules à double membrane appelées autophagosomes, caractéristiques de l'autophagie canonique. De nombreuses vésicules à simple membrane contenant des bactéries ont été également observées et des résultats préliminaires en microscopie corrélative semblent indiquer une colocalisation de LC3 avec ces vésicules, suggérant également l'induction d'un processus de LAP. Mon travail de thèse a donc permis de mettre en évidence l'induction des voies d'autophagie et de LAP lors d'une infection de MAs par B. pertussis. Enfin, l'implication de la LAP dans la clairance de la bactérie a été démontrée.

Résumé traduit

Whooping cough, caused by the bacteria B. pertussis, is a respiratory disease responsible for more than 19.5 million cases worldwide and more than 117,000 deaths per year, mainly among young children. Following infection, B. pertussis will progress through the respiratory tract and encounter alveolar macrophages (AMs) which constitute the major innate immune population of the alveoli. These cells play a key role in eliminating the bacteria. Nevertheless, it has been shown that B. pertussis is capable of modulating their response in order to escape degradation. Additionally, B. pertussis can persist inside macrophages for several days, suggesting that these cells could provide a reservoir for the bacteria. In order to understand the origin of this persistence, it is necessary to characterize the degradation pathways involved by AMs during infection. However, the study of the interaction of B. pertussis with AMs is complex because cellular models such as Thp-1 cells or Raw 264.7 cells are phenotypically distant from MAs. Furthermore, the extraction of primary murine MAs requires the use of numerous animals.In this work, I evaluated the MPI cells as a new model for studying the interaction of B. pertussis with AMs. MPI cells are murine macrophage cell line established from fetal liver cells which, in the presence of GM-CSF, proliferate and exhibit functionalities similar to alveolar macrophages. After defining the optimal infection conditions, I showed that bacteria are internalized by MPI cells and then rapidly degraded. This bacterial clearance is associated with the induction of a pro-inflammatory response similar to that observed during infection of primary murine AMs by B. pertussis. Interestingly, this increase in the secretion of pro-inflammatory cytokines is associated with a decrease in the activation of the transcription factors STAT3 and STAT5 in infected MPI cells.The MPI model was then used to study the intracellular degradation mechanisms involved by AMs during infection by B. pertussis. It has been shown that B. pertussis is able to escape phagocytosis, which implies for macrophages the need to induce other degradation pathways to eliminate the bacteria. During infection with M. tuberculosis and S. pneumoniae, the involvement of autophagy and LC3-associated phagocytosis (LAP) pathways in clearance of the pathogen has been established but the role of these processes in pathogenesis of B. pertussis has never been described so far.During this work, I showed that infection by B. pertussis induces an increase in the expression of the LC3 protein and the accumulation of the lipidated form LC3-II, a key marker of autophagy and of LAP. The induction of other proteins specifically involved in autophagy such as p62 and ATG5 was also observed. At the same time, a decrease in the activation of mTOR and the expression of Rubicon, which constitute two negative regulators of autophagy, was detected. Finally, following infection of MPI by B. pertussis, we observed by transmission electron microscopy the formation of double-membrane vesicles called autophagosomes, characteristic of canonical autophagy. Numerous single-membrane vesicles containing bacteria were also observed and preliminary results in correlative microscopy seem to indicate colocalization of LC3 with these vesicles, also suggesting the induction of a LAP process. Therefore, my PhD highlighted the induction of autophagy and LAP pathways during infection of AMs by B. pertussis. Finally, the involvement of LAP in the clearance of the bacteria has been demonstrated.