• Langue : Anglais
• Discipline : Chimie théorique, physique, analytique
• Identifiant : 2024ULILR077
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 17/12/2024

Résumé en langue originale

Parmi toutes les applications des protéines fluorescentes, leur utilisation comme marqueurs en microscopie de fluorescence est sans doute la plus répandue, une découverte marquée par le Prix Nobel de Chimie en 2008. Ces dernières années ont vu l'émergence des protéines photo-commutables réversibles (RSFPs) qui se caractérisent par une commutation réversible, photo-induite, entre un état fluorescent (ON) et un état non fluorescent (OFF). Leur intérêt se place en microscopie de fluorescence super-résolue (nanoscopie) pour atteindre des résolutions spatiales nanométriques (Prix Nobel de Chimie 2014). Les paramètres et vitesse d'acquisition de l'image tout comme la résolution sont étroitement liés aux propriétés photo-physiques et à la photo-dynamique de commutation de ces protéines. Aujourd'hui, les efforts se concentrent sur le développement de protéines fluorescentes photo-commutables fonctionnant dans le proche infrarouge, des longueurs d'onde idéales pour l'imagerie biologique en profondeur. Le groupe du Professeur Stefan Jakobs de l'Institut Max Planck pour les Sciences Interdisiplinaires à Göttingen a ainsi développé PENELOPE, la première RSFP fonctionnant en nanoscopie dans le proche infrarouge (λex = 690 nm, λem = 720 nm) avec retour thermique in vitro milliseconde. PENELOPE est un dérivé du bactériophytochrome sauvage de Deinococcus radiodurans (Dr-PSM). La forme stable de Dr-PSM absorbe dans le rouge (Pr, état ON) et se transforme sous irradiation en une forme absorbant dans le proche infrarouge (Pfr, état OFF). Le retour thermique est de l'ordre de quelques jours. Le développement de nouveaux mutants basés sur PENELOPE nécessitent une compréhension approfondie de son mécanisme de photo-commutation, en particulier pour identifier les espèces qui contrôlent ses rendements quantiques de fluorescence et de commutation, et son retour thermique rapide. La photo-commutation de Pr vers Pfr des bactériophytochromes sauvages implique plusieurs processus, dont l'isomérisation picoseconde cis-trans du chromophore biliverdine, des étapes de déprotonation et reprotonation millisecondes accompagnés de changements structuraux dans la protéine avec une formation de l'état final Pfr en une centaine de milliseconde. La photodynamique fait ainsi intervenir plusieurs états excités et intermédiaires dont les temps de vie couvrent quinze ordres de grandeurs, de la femtoseconde à la seconde. Dans cette thèse, la photodynamique de PENELOPE a été étudiée à l'aide de la spectroscopie optique résolue dans le temps de fluorescence et d'absorption transitoire UV-Vis-NIR, couvrant une gamme de temps allant de la femtoseconde à la seconde. Une comparaison est faite avec des variants de la protéine sauvage possédant (i) un retour thermique accéléré (Dr-CBDmono) ou étant (ii) fluorescents mais non photo-commutables (SNIFP). Cette comparaison a permis d'identifier deux états excités spécifiques qui contrôlent respectivement la fluorescence et l'isomérisation. La photo-activation de PENELOPE à partir de l'état ON (état Pr) se caractérise par la formation en quelques millisecondes de l'état OFF dont la signature en absorption visible et Raman est comparable à celle du précurseur de Pfr pour la protéine sauvage. Cet état OFF possède un retour thermique vers Pr d'une dizaine d'heures pour la protéine purifiée, accéléré de plusieurs ordres de grandeur in vitro, i.e. lorsqu'elle est exprimée dans E coli. Les résultats de ces études vont permettre la conception de nouveaux variants de bacteriophytochromes pour la nanoscopie en profondeur.

Résumé traduit

Among all the applications of fluorescent proteins, their use as markers in fluorescence microscopy is undoubtedly the most widespread, a discovery recognized by the Nobel Prize in Chemistry in 2008. In recent years, reversible switchable fluorescent proteins (RSFPs) have emerged, characterized by a reversible, photo-induced switching between a fluorescent (ON) state and a non-fluorescent (OFF) state. Their relevance lies in their use in super-resolution fluorescence microscopy (nanoscopy) to achieve nanometric spatial resolutions, a breakthrough that earned the Nobel Prize in Chemistry in 2014. The imaging acquisition parameters, speed, and resolution are closely tied to the photophysical properties and switching photodynamics of these proteins. Today, efforts are focused on developing photo-switchable fluorescent proteins that operate in the near-infrared (NIR) range, which offers ideal wavelengths for deep-tissue biological imaging. Professor Stefan Jakobs' group at the Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences in Göttingen has developed PENELOPE, the first RSFP to function in NIR nanoscopy (λex = 690 nm, λem = 720 nm) with an in vitro millisecond thermal recovery. PENELOPE is a derivative of the wild-type bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans (Dr-PSM). The stable form of Dr-PSM absorbs in the red (Pr, ON state) and, upon irradiation, converts into a form that absorbs in the near-infrared (Pfr, OFF state). Its thermal recovery takes several days. Developing new mutants based on PENELOPE requires a deep understanding of its photo-switching mechanism, particularly to identify the species that control its fluorescence and switching quantum yields, as well as its rapid thermal recovery. The photo-switching from Pr to Pfr in wild-type bacteriophytochromes involves multiple processes, including a picosecond cis-trans isomerization of the biliverdin chromophore, millisecond deprotonation and reprotonation steps, and structural changes in the protein, leading to the formation of the final Pfr state within hundreds of milliseconds. The photodynamics thus involves several excited and intermediate states, with lifetimes spanning fifteen orders of magnitude, from femtoseconds to seconds. In this thesis, the photodynamics of PENELOPE was studied using time-resolved optical spectroscopy, including fluorescence and transient absorption UV-Vis-NIR, covering a time range from femtoseconds to seconds. A comparison was made with variants of the wild-type protein exhibiting (i) accelerated thermal recovery (Dr-CBDmono) or (ii) fluorescence without photo-switching capabilities (SNIFP). This comparison allowed for the identification of two specific excited states that control fluorescence and isomerization, respectively. The photoactivation of PENELOPE from the ON state (Pr state) is characterized by the formation of the OFF state within a few milliseconds, with an absorption and Raman signature similar to that of the Pfr precursor in the wild-type protein. This OFF state exhibits a thermal recovery to Pr over a period of several hours for the purified protein, which is accelerated by several orders of magnitude in vitro, i.e., when expressed in E. coli. The results of these studies will contribute to the design of new bacteriophytochrome variants for deep-tissue nanoscopy.