• Langue : Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2023ULILS115
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 20/12/2023

Résumé en langue originale

Le cancer de l'ovaire (OvCa) est le cancer le plus mortel parmi les cancers féminins. Il est souvent diagnostiqué tardivement ou mal diagnostiqué, ce qui le rend difficile à traiter. Les options de traitement incluent la chirurgie ou la chimiothérapie, toutefois la résistance à la chimiothérapie est un problème majeur. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles et de développer de nouvelles stratégies pour surmonter cette résistance.Dans ce contexte le protéome fantôme est une source potentiellement riche de biomarqueurs. Le protéome fantôme, ou protéome alternatif, est composé de protéines traduites à partir de cadres de lecture ouverts alternatifs (AltORFs). Ces AltORFs proviennent de différents codons START issus de différente région de l'ARNm, tels qu'un décalage de cadre de lecture (+1, +2) dans la séquence codante de l'ADN (CDS), dans le 5'-UTR, 3'-UTR et éventuellement de la traduction d'ARN non codants (ncRNA).Les études sur les protéines alternatives (AltProts) sont souvent complexes et nécessite des études biomoléculaires coûteuses. Cependant, leurs fonctions peuvent être déduites en identifiant leurs partenaires d'interaction, la détection des interactions protéine-protéine (PPI) entre AltProts et protéines de référence (RefProts) peut aider à identifier leur fonction. La stratégie de pontage chimique (crosslink) combiné à la spectrométrie de masse (XL-MS) est un outil approprié à cet objectif. De plus, les outils bioinformatiques qui relient les informations fonctionnelles des RefProt et les analyses d'ontologie génique (GO) permettent la visualisation des voies de signalisation et le regroupement des RefProts en fonction de leur processus biologique, de leur fonction moléculaire ou de leur localisation cellulaire, et ainsi y placer certaine AltProt.Dans ce travail, nous avons développé une méthodologie combinant XL-MS et le fractionnement subcellulaire. L'étape de fractionnement subcellulaire nous a permis de réduire la complexité des échantillons analysés par chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC-HRMS/MS). Pour évaluer la validité des interactions, nous avons réalisé une modélisation moléculaire des structures 3D des AltProts, suivie d'une prédiction informatique de l'interaction et de mesure des distances de pontages identifiés expérimentalement. L'analyse a révélé des rôles d'AltProts dans les fonctions et les processus biologiques tel que la réparation de l'ADN ou encore la présentation d'antigène.La protéogénomique a été utilisée pour générer des bases de données protéiques personnalisées à partir des données de séquençage ARN afin d'étudier les protéomes de deux lignées cellulaires de cancer de l'ovaire (PEO-4 et SKOV-3) en comparaison avec une lignée cellulaire ovarienne normale (T1074). L'expression différentielle de plusieurs protéines a ainsi été identifiée entre les lignées cellulaires cancéreuses et normales, avec une association aux voies de signalisation connues pour le cancer. Des PPI ont également été identifiées dans les lignées cellulaires cancéreuses en utilisant la méthodologie XL-MS.Ce travail met en évidence le potentiel de l'approche protéogénomique pour découvrir de nouveaux aspects de la biologie du cancer de l'ovaire. Il nous permet d'identifier des protéines et des variants auparavant inconnus qui peuvent avoir une signification fonctionnelle. L'utilisation de bases de données protéiques personnalisées et de l'approche de réticulation a mis en lumière le "protéome fantôme", une vision du protéome restée inexplorée jusqu'à présent.

Résumé traduit

Ovarian cancer (OvCa) has the highest mortality rate among female reproductive cancers worldwide. OvCa is often referred to as a stealth killer because it is commonly diagnosed late or misdiagnosed. Once diagnosed, OvCa treatment options include surgery or chemotherapy. However, chemotherapy resistance is a significant obstacle. Therefore, there is an urgent need to identify new targets and develop novel therapeutic strategies to overcome therapy resistance.In this context the ghost proteome is a potentially rich source of biomarkers. The ghost proteome, also known as the alternative proteome, consists of proteins translated from alternative open reading frames (AltORFs). These AltORFs originate from different start codons within mRNA molecules, such as the coding DNA sequence (CDS) in frameshifts (+1, +2), the 5'-UTR, 3'-UTR, and possible translation products from non-coding RNAs (ncRNA).Studies on alternative proteins (AltProts) are often limited due to their case-by-case occurrence and complexity. Obtaining functional protein information for AltProts requires complex and costly biomolecular studies. However, their functions can be inferred by profiling their interaction partners, known as "guilty by association" approaches. Indeed, assessing AltProts' protein-protein interactions (PPIs) with reference proteins (RefProts) can help identify their function and set them as research targets. Since there is a lack of antibodies against AltProts, crosslinking mass spectrometry (XL-MS) is an appropriate tool for this task. Additionally, bioinformatic tools that link protein functional information through networks and gene ontology (GO) analysis are also powerful. These tools enable the visualization of signaling pathways and the grouping of RefProts based on their biological process, molecular function, or cellular localization, thus enhancing our understanding of cellular mechanisms.In this work, we developed a methodology that combines XL-MS and subcellular fractionation. The key step of subcellular fractionation allowed us to reduce the complexity of the samples analyzed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). To assess the validity of crosslinked interactions, we performed molecular modeling of the 3D structures of the AltProts, followed by docking studies and measurement of the corresponding crosslink distances. Network analysis indicated potential roles for AltProts in biological functions and processes. The advantages of this workflow include non-targeted AltProt identification and subcellular identification.Additionally, a proteogenomic analysis was performed to investigate the proteomes of two ovarian cancer cell lines (PEO-4 and SKOV-3 cells) in comparison to a normal ovarian epithelial cell line (T1074 cell). Using RNA-seq data, customized protein databases for each cell line were generated. Differential expression of several proteins, including AltProts, was identified between the cancer and normal cell lines. The expression of some RefProts and their transcripts were associated with cancer-related pathways. Moreover, the XL-MS methodology described above was used to identify PPIs in the cancerous cell lines.This work highlights the significant potential of proteogenomics in uncovering new aspects of ovarian cancer biology. It enables us to identify previously unknown proteins and variants that may have functional significance. The use of customized protein databases and the crosslinking approach have shed light on the "ghost proteome," an area that has remained unexplored until now.