• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2023ULILS112
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 08/12/2023

Résumé en langue originale

Les Norovirus (NoVs) sont la principale cause de gastro-entérite dans le monde. Les contaminations se produisent principalement de personne à personne ou par la consommation d'aliments contaminés comme les fruits, les légumes ou les crustacés. Dans ce dernier cas, l'huître est connue pour être un excellent vecteur, notamment en raison de sa consommation crue, de sa proximité avec les effluents humains, de sa capacité de filtration et de sa rétention spécifique des NoVs. En utilisant différentes lectines, anticorps et virus-like particles (VLPs), il a été démontré que la rétention spécifique des NoVs repose sur la présence de l'antigène A (Ag A) chez l'huître.Afin de mettre en évidence la présence et la distribution d'antigènes de groupes sanguins tissulaires sur les glycoconjugués des espèces d'huîtres Crassostrea gigas et Ostrea edulis, nous avons établi les N et O-glycomes du manteau, des branchies et du tissu digestif. Les N glycannes ont été séquentiellement libérés par la Peptide:N-glycosidase F (PNGase F) et A. Après perméthylation, les analyses structurales par MALDI-QIT-TOF ont révélé la présence des Ags A et A Lewis b (ALeb) pour les deux espèces ainsi que des antigènes H et HLeb uniquement pour O. edulis. La deutéroperméthylation à la place de la perméthylation suivie d'analyses MALDI-MSn ont permis de montrer la présence de N-glycannes naturellement méthylés comme cela a été démontré chez l'huître Crassostrea virginica. Pour identifier les monosaccharides porteurs de groupements méthyles et préciser leur position, les monosaccharides des N glycannes ont été transformés en leur dérivé itol acétate et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse EI-MS. Nous avons ainsi pu révéler la présence d'un groupement méthyle sur le carbone 3 des résidus de N acétylgalactosamine des Ags A pour les deux espèces. Des résidus de fucose sont aussi apparus méthylés sur leur carbone 3 ou 4 pour les huîtres C. gigas et O. edulis, respectivement. Ces résidus de méthyl-fucose ont été identifiés dans l'antigène Leb pour les deux espèces et dans l'Ag A uniquement pour O. edulis.Dans le but d'étendre ces analyses aux O glycannes, un protocole de préparation des mucines a été mis en œuvre et les O-glycannes ont été libérés par β-élimination réductive, perméthylés ou perdeutérométhylés et analysés par spectrométrie de masse MSn. Nos résultats indiquent également la présence d'Ags A mais également d'Ags H pour les deux espèces. La présence d'Ags Leb est également suspectée. De plus, la présence de groupements méthyles au sein des O glycannes natifs a été mise en évidence.En parallèle, des expériences ELISA et de Far-Western Blotting (FarWB) utilisant des VLPs dérivées des NoVs GI.1 et GII.4 ont été réalisées pour déterminer la ou les macromolécules des deux espèces impliquées dans l'interaction hôte-virus. Les résultats ont démontré une reconnaissance différentielle des tissus d'huîtres par les deux génotypes. Les données préliminaires obtenues par FarWBs indiquent sans ambiguïté que les ligands du virus sont associés à des glycoprotéines de très haut poids moléculaire. L'élimination des N glycannes par la PNGase F n'affecte pas la reconnaissance par les VLPs. L'ensemble de ces résultats suggèrent fortement que seuls les O-glycannes seraient impliqués dans la reconnaissance NoV-huître et pourraient appartenir à des glycoprotéines de type mucine. La présence de mucines chez les mollusques n'a pas encore été formellement démontrée.

Résumé traduit

Noroviruses (NoVs) are the most common cause of gastroenteritis worldwide. Contamination occurs mainly from person to person or through the consumption of contaminated foods such as fruits, vegetables or shellfish. In the latter case, oysters are known to be excellent vectors, particularly due to their raw consumption, proximity to human sewage, filtration capacity and specific retention of NoVs. Using various lectins, antibodies and virus-like particles (VLPs), it has been demonstrated that specific retention of NoVs relies on the presence of A antigen (A Ag) in oysters.To highlight the presence and distribution of Histo-blood group antigens on glycoconjugates from the oyster species Crassostrea gigas and Ostrea edulis, we established N and O-glycomes from mantle, gills and digestive tissue. N-glycans were sequentially released by peptide:N-glycosidase F (PNGase F) and A. After permethylation, structural analyses by MALDI-QIT-TOF revealed the presence of A and A Lewis b (ALeb) Ags for both species, as well as H and HLeb Ags for O. edulis only. Deutero-permethylation instead of permethylation, followed by MALDI-MSn analyses revealed the presence of naturally methylated N glycans, as demonstrated in the oyster Crassostrea virginica. To identify the monosaccharides carrying methyl groups and specify their position, the N-glycans monosaccharides were converted into their itol acetate derivative and analyzed by gas chromatography coupled with EI-MS mass spectrometry. This revealed the presence of a methyl group on carbon 3 of N acetylgalactosamine residues in A Ags for both species. Fucose residues also appeared methylated on their carbon 3 or 4 for C. gigas and O. edulis oysters, respectively. These methyl-fucose residues were identified in Leb Ag for both species, and in A Ag only for O. edulis. To extend these analyses to O-glycans, a mucin preparation protocol was implemented and O-glycans were released by reductive β-elimination, permethylated or perdeuteromethylated and analysed by MSn mass spectrometry. Our results also indicate the presence of A Ags but also H Ags for both species. The presence of Leb Ags is also suspected. The presence of methyl groups within native O-glycans was also demonstrated.In parallel, ELISA and Far-Western Blotting (FarWB) experiments using VLPs derived from NoVs GI.1 and GII.4 were carried out to determine the macromolecule(s) of the two species involved in the host-virus interaction. The results demonstrated differential recognition of oyster tissues by the two genotypes. Preliminary data obtained by FarWBs unambiguously indicate that the virus ligands are associated with very high molecular weight glycoproteins. Removal of N glycans by PNGase F does not affect recognition by VLPs. Taken together, these results strongly suggest that only O-glycans are involved in NoV-oyster recognition and may belong to mucin-type glycoproteins. The presence of mucins in mollusks has not yet been formally demonstrated.