• Langue : Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2023ULILS108
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 06/09/2023

Résumé en langue originale

Contrairement aux humains qui ne génèrent qu'un seul type de polymère constitué d'acides N-acétylneuraminiques liés en α2,8, les poissons sont capables de générer une large gamme d'acides polysialiques variant selon l'ordre des téléostéens (Salmoniformes, Cypriniformes, …). Alors que deux poly-α-2,8-sialyltransférases humaines ST8Sia II et ST8Sia IV sont responsables de la synthèse de polyNeu5Ac sur un nombre limité de glycoprotéines, la machinerie de biosynthèse des poissons conduisant à la biodiversité de polySia n'est actuellement pas connue. En effet, des études phylogénétiques des ST8Sia ont révélé une distribution particulière des gènes de polyST de poisson par rapport à ceux humains. Trois gènes de polyST st8sia4, st8sia2-r1 et st8sia2-r2 ont été identifiés dans le génome des salmonidés et pourraient être impliqués dans la biosynthèse de ces polySia.Au cours de mon doctorat, j'ai conçu des polyST solubles et étiquetées du salmonidé Coregonus maraena par clonage moléculaire et j'ai produit ces enzymes recombinantes dans le milieu de culture de cellules de mammifères transitoirement transfectées. En parallèle, j'ai synthétisé chimio-enzymatiquement du CMP-Neu5Ac, CMP-Neu5Gc et CMP-Kdn, à partir des trois principaux acides sialiques rapportés chez les vertébrés (i.e. Neu5Ac, Neu5Gc et Kdn), pour les utiliser comme substrats donneurs naturels dans les réactions de sialylation. J'ai également préparé divers substrats accepteurs ainsi qu'un donneur d'acide sialique fonctionnalisé avec un alcyne (i.e. CMP-SiaNAl) pour des approches bioorthogonales de chimie-clic. En utilisant ces outils de biosynthèse spécifiques et le test MPSA récemment développé, j'ai optimisé les conditions des essais de polysialylation (température, pH, durée) et comparé les activités des enzymes de poisson et humaines. J'ai notamment réalisé la caractérisation biochimique de ST8Sia IV de poisson en MPSA, démontré son activité préférentielle sur des substrats accepteurs connus pour les polySTs humaines (NRP-2 et DNAse I) et sur d'autres accepteurs (PSGP, orosomucoïde, BSM et ALCAM). Notamment en utilisant l'ALCAM en MPSA, j'ai déterminé les paramètres cinétiques des ST8Sia IV humaine et de corégone et montré leurs différences d'affinités envers le CMP-SiaNAl.Ensuite, j'ai effectué des réactions de polysialylation avec du CMP-Neu5Ac, CMP-Neu5Gc et CMP-Kdn dans des essais in vitro et cellulaires suivis d'analyses structurales de produits polysialylés en utilisant l'anticorps monoclonal anti-polySia 735 et l'endoneuraminidase-N. J'ai pu démontrer des spécificités de substrat uniques de l'enzyme de poisson par rapport à son homologue humaine. J'ai montré que C.maraena ST8Sia IV présente un intérêt particulier pour modifier les glycoprotéines avec des différences notables dans la reconnaissance des substrats pour générer des polymères in vitro et de surface cellulaire composés de Neu5Ac, Neu5Gc et Kdn.Afin de comprendre comment cette voie de polysialylation est régulée chez les vertébrés, l'influence de l'autopolysialylation a été étudiée. Comme rapporté pour les polyST de mammifères, j'ai également montré que l'autopolysialylation est possible pour ST8Sia IV de poisson mais n'est pas essentielle à son activité catalytique.Enfin, la modélisation de structure 3D de polyST a été initiée à l'aide d'AlphaFold et a révélé des boucles désordonnées et changements d'acides aminés dans les sialylmotifs conservés et les motifs PBR et PSTD. Ces differences de structure entre polyST humaines et de poisson pourraient être impliquées dans des interactions dimériques potentielles, une flexibilité du domaine catalytique et pourraient expliquer les spécificités enzymatiques des polyST de poisson.Ces études ont mis en lumière la structure-fonction des polyST de vertébrés et ouvrent la voie à la synthèse de matériaux innovants polysialylés qui seront combinés à des biomolécules antimicrobiennes pour le développement de nouvelles surfaces bioactives à l'avenir.

Résumé traduit

In contrast to humans that generate only a single type of polymer consisting of α2,8-linked N-acetylneuraminic acid polyNeu5Ac, fishes are able to generate a wide range of different polysialic acids varying according to teleosts order (Salmoniformes, Cypriniformes, …). While two human poly-α-2,8-sialyltransferases ST8Sia II and ST8Sia IV are responsible for polyNeu5Ac synthesis onto a limited number of glycoproteins, the fish biosynthetic machinery leading to the polySia biodiversity is currently not known. Indeed, phylogenetic studies of the α2,8-sialyltransferases ST8Sia revealed a particular distribution of fish polysialyltransferases compared to their human homologs. Three polysialyltransferase genes st8sia4, st8sia2-r1 and st8sia2-r2 were identified in the salmonids genome that could be involved in the biosynthesis of these polySia.During my PhD, I engineered soluble and tagged polysialyltransferases from the salmonid Coregonus maraena by molecular cloning and produced these recombinant enzymes in the cell culture medium of transiently transfected mammalian cells. In parallel, I have chemo-enzymatically synthetized CMP-Neu5Ac, CMP-Neu5Gc and CMP-Kdn activating the three main sialic acids reported in vertebrates (i.e. Neu5Ac, Neu5Gc and Kdn) to use them as natural donor substrates in sialylation reactions. I have also prepared various acceptor substrates as well as a functionalized sialic acid donor with a small alkyne group (i.e. CMP-SiaNAl) which allow bioorthogonal click-chemistry approaches. Using these specific biosynthetic tools and the recently developed MicroPlate Sialyltransferase Assay (MPSA), I optimized polysialylation assay conditions (temperature, pH, time-course) and compared enzymatic activities of the fish and human enzymes. Notably, I achieved the biochemical characterization of the fish ST8Sia IV on MPSA, demonstrated its preferential activity onto known acceptor substrates for the human polysialyltransferases like NRP-2 and DNAse I and on other acceptors like PSGP, orosomucoid, BSM and ALCAM. Notably using ALCAM on MPSA, I determined kinetic parameters for the human and coregone ST8Sia IV showing differences of affinities towards CMP-SiaNAl.Then, I carried out polysialylation reactions with CMP-Neu5Ac, CMP-Neu5Gc and CMP-Kdn in cell-free and cell-based assays and structural analyses of polysialylated products using the anti-polySia monoclonal antibody 735 (mAb735) and endoneuraminidase-N (endoN). I could demonstrate unique substrate specificities of the fish enzyme compared to its human homologue. I showed that C. maraena ST8Sia IV is of particular interest to modify glycoproteins with notable differences in substrates recognition to generate in vitro and cell surface polymers made up of Neu5Ac, Neu5Gc and Kdn.In an effort to understand how this polysialylation pathway is regulated in vertebrates, influence of autopolysialylation was studied. As reported for mammalian polysialyltransferases, I have also shown that autopolysialylation is possible for the fish ST8Sia IV but is not essential for its catalytic activity.Finally, modeling of the 3D structure of polysialyltransferases using AlphaFold was initiated and has revealed disordered loops and specific amino-acid changes in conserved sialylmotifs, PBR and PSTD motifs. These structural differences between human and salmonid polysialyltransferases might be involved in potential dimeric interactions, flexibility of the catalytic domain and could explain the enzymatic specificities of salmonid polysialyltransferases.These studies shed light on structure-function of vertebrate polyST and paved the way for the synthesis of innovative polySia-based materials which will be combined to antimicrobial biomolecules for the development of novel bioactive surfaces in the future.