• Langue : Anglais, Français
• Discipline : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique
• Identifiant : 2023ULILS025
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 21/06/2023

Résumé en langue originale

L'intérêt pour les applications cliniques des lysats plaquettaires humains (HPL) en médecine régénérative est en hausse. Le contrôle de qualité et la documentation du matériel de départ et du mode de préparation sont importants pour une utilisation clinique directe. Les avantages cliniques de ces préparations de plaquettes sont considérés comme étant liés à leur contenu en nombreux facteurs de croissance. Le HPL purifié riche en facteurs neurotrophiques a montré qu'il fournissait une neuroprotection et une neuro-restauration aux neurones dopaminergiques dans des modèles de maladie de Parkinson (PD) et de traumatisme crânien (TBI) in vitro et in vivo. La sécurité virale est également une préoccupation, en particulier avec les HPL préparés à partir de produits sanguins et produits à plus grande échelle pour l'administration cérébrale. Nos études préliminaires montrent que le matériau initial, le concentré plaquettaire (CP), et les HPL contiennent des vésicules extracellulaires (EV), soulevant des questions sur la contribution potentielle de ces PEV à leur activité fonctionnelle.Nos objectifs étaient d'évaluer (a) la composition et l'activité fonctionnelle de divers HPL, y compris celle apportée par les EV, destinés à des indications cliniques spécifiques; (b) l'efficacité de l'élimination des virus par nanofiltration et l'impact sur les compositions chauffées-HPL et leurs fonctions thérapeutiques de neuroprotection et de neuro-régénération; et (c) le profil de caractérisation bio-physique et de fonction biologique des préparations PEV sélectionnées, ainsi que leurs. Nous avons obtenu des concentrés de plaquettes humaines auprès du Centre du sang de Taipei et les avons transformés en différents lysats. Les lysats ont été quantifiés pour leur teneur en facteurs de croissance, testés pour leur activité fonctionnelle et leurs propriétés anti-oxydantes. Les HPL neuroprotecteurs chauffés ont été purifiés à l'aide de la nanofiltration Planova-20N pour éliminer les virus. Leur efficacité a été évaluée in vitro et in vivo. Nous avons également évalué l'activité neuroprotectrice exercée par certaines préparations de PEVs et le NHPPL en utilisant des modèles de cellules. Les PEVs ont montré un effet anti-inflammatoire sur les cellules microgliales BV-2. Nous avons mené une étude in vivo pour confirmer leur capacité à exercer une activité fonctionnelle lorsqu'ils sont administrés par voie intranasale, en particulier leur potentiel à moduler les cytokines inflammatoires, et pour évaluer leur capacité à protéger les cellules dopaminergiques dans un modèle animal de la maladie de Parkinson.Nos résultats ont révélé que toutes les cinq préparations de HPL contenaient des niveaux supraphysiologiques détectables de tous les facteurs de croissance évalués, sauf le facteur de croissance analogue à l'insuline-1 détecté uniquement dans le HPL contenant du plasma. Des différences significatives ont été observées parmi ces HPL en termes de teneur en protéines totales, en fibrinogène, en composants du complément C3 et C4, en albumine et en immunoglobuline G, et surtout en termes de leurs activités coagulantes et procoagulantes fonctionnelles et de leurs capacités antioxydantes. Le HPPL nanofiltré, dépourvu de PEVs, a préservé une gamme de facteurs neurotrophiques et leur activité fonctionnelle. Les PEVs isolés du surnageant de concentré plaquettaire ont exercé une activité neuroprotectrice dans le modèle de neurones dopaminergiques LUHMES de la maladie de Parkinson, ont stimulé la différenciation des cellules neuronales SH-SY5Y et ont montré une fonction anti-inflammatoire préservée lors d'une administration intranasale dans un modèle murin de traumatisme cérébral, ainsi qu'une protection des marqueurs positifs de la tyrosine hydroxylase contre l'intoxication par le MPTP chez les souris.

Résumé traduit

Interest in clinical applications of human platelet lysates (HPLs) in regenerative medicine is increasing. Quality control and documentation of starting material and preparation mode are important for direct clinical use. The clinical benefits of these platelet preparations are thought to be related to their content in numerous growth factors. Neurotrophic factor-rich purified HPL has been shown to provide neuroprotection and neuro-restoration to dopaminergic neurons in Parkinson's disease (PD) and traumatic brain injury (TBI) models in vitro and in vivo. Virus safety is also a concern, especially with HPL prepared from blood products and produced on a larger scale for brain administration. Our preliminary studies show that the initial material, platelet concentrate (PC), and HPLs contain extracellular vesicles (EVs), raising questions about the potential contribution of these PEVs to their functional activity. Our aims were to assess (a) the composition and functional activity of various HPLs, including that contributed by EVs, intended for specific clinical indications; (b) the efficacy of virus removal by nanofiltration and the impact on the heated-HPL compositions and their neuroprotective and neuro-regenerative therapeutic functions; and (c) the profile of selected PEVs preparations' biophysical characterization, biological functions, and their neuroprotection and neuro-regeneration roles.We obtained human platelet concentrates (PCs) from Taipei Blood Center and processed them into different platelet lysates. HPLs were quantified in their growth factors, biochemical analysis, thrombin activity, tested for PEVs functional activity, and anti-oxidative properties. Virus removal in the neuroprotective heated-HPL (HPPL) was done using nanofiltration technology Planova-20N. The virus removal efficacy was evaluated by spiking small virus of mice-mock particles and immunoquantitative PCR analysis. The nanofiltration impact to the HPPL compositions and functionals was evaluated in vitro and in vivo. We assessed the neuroprotective activity exerted by selected PEVs preparations and the nanofiltered HPPL (NHPPL) using LUHMES cells model of PD. Their neuro-regenerative potentials were assessed using SH-SY5Y neuroblastoma cells. BV-2 microglia cells induced LPS was used to evaluate PEVs anti-inflammatory effect. Moreover, we conducted an in vivo study in a controlled cortical impact (CCI), traumatic brain injury (TBI) model to confirm their capacity to exert a functional activity when administered intranasally, in particular, the potential to modulate inflammatory cytokines. We also evaluated the PEVs capacity to protect tyrosine hydroxylase (TH), a marker of dopaminergic cells in MPTP mice model of PD.Our results revealed that all five HPL preparations contained detectable supraphysiological levels of all growth factors assessed, except insulin-like growth factor-1 detected only in HPL containing plasma. There were significant differences observed among these HPLs in total protein content, fibrinogen, complement components C3 and C4, albumin, and immunoglobulin G, and, most importantly, in their functional coagulant and procoagulant activities and antioxidative capacities. The nanofiltered HPPL depleted of EVs, preserved a range of neurotrophic factors and their functional activity. EVs isolated from platelet concentrate supernatant exerted neuroprotective activity in LUHMES dopaminergic neuron model of Parkinson's disease, stimulated the differentiation of SH-SY5Y neuronal cells, and showed preserved anti-inflammatory function upon intranasal administration in a mouse model of traumatic brain injury, as well as protection of tyrosine hydroxylase-positive markers against MPTP intoxication in mice.