• Langue : Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2023ULILS015
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 18/04/2023

Résumé en langue originale

Les mutations de la Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) sont liées à la maladie de Parkinson (MP). Le gène LRRK2 code pour une protéine multiphosphorylée comportant plusieurs domaines fonctionnels impliqués dans l'interaction protéine-protéine, la GTPase et l'activité kinase. Le ciblage de l'activité kinase de LRRK2 fait l'objet de nombreuses recherches, et plusieurs composés sont en cours d'évaluation en test clinique. D'autres fonctions de LRRK2 sont également étudiées pour leurs liens avec les pathomécanismes de la MP. Des études suggèrent que la phosphorégulation de LRRK2 est essentielle à son fonctionnement pathologique et physiologique. LRRK2 comprend deux types de sites de phosphorylation, à savoir les sites hétérologues et d'autophosphorylation. Un groupe de phosphosites hétérologues (S910, S935, S955, S973) présente une phosphorylation réduite dans les cerveaux atteints de la MP sporadique, dans les mutants de LRRK2 et après l'inhibition pharmacologique de l'activité kinase de LRRK2. L'état de phosphorylation de LRRK2 influence sa localisation subcellulaire. Ces résultats ont conduit à l'identification de PP1 et PP2A comme phosphatases déphosphorylant les sites hétérologues de LRRK2. Notre équipe s'intéresse à l'étude des conséquences de la déphosphorylation de LRRK2 et du rôle de ses phosphatases, avec un intérêt particulier pour la modulation de cette interaction comme nouvelle approche thérapeutique pour la MP. Par conséquent, la présente thèse de doctorat vise à déterminer les phénotypes de LRRK2 dans différents états de phosphorylation, et à réaliser des études d'interaction physique et fonctionnelle entre LRRK2 et PPP.Les résultats obtenus dans ce projet de thèse démontrent qu'il n'y a pas d'altération significative de la stabilité des phosphomutants purifiés de LRRK2 (S860/910/935/955/973/976 6x S>D/A) par rapport au WT. Nous confirmons l'hyperactivation de l'autophosphorylation induite par RAB29 sur un phosphomutant mimant la déphosphorylation (6xS>A). Il est intéressant de noter que l'expression de RAB29 affecte les niveaux totaux de LRRK2 de certains phosphomutants et du mutant R1441G. Le modèle de Drosophila melanogaster exprimant la forme 6xS>D du LRRK2 humain présente une sensibilité accrue au stress lysosomal induit par la chloroquine, par rapport aux mouches 6xS>A et WT. En outre, un lien fonctionnel entre LRRK2 et la sous-unité catalytique de PP1 (Ppp1CA) a été mis en évidence par une analyse protéomique et immunoblot des vésicules extracellulaires urinaires (uEV) de rats ; la présence de Ppp1CA est multipliée par trois dans les uEV de rats LRRK2 KO par rapport aux rats WT. Concernant l'interaction physique entre LRRK2 et ses phosphatases, une interaction in vivo entre LRRK2 endogène et Ppp1CA et Ppp2CA est confirmée dans le cerveau de rats (avec LRRK2 KO comme témoin). De plus, des coIPs ont été réalisées pour cartographier l'interaction entre LRRK2 et PPP2CA, avec des points de contact pour PPP2CA dans les domaines Ankyrine, Kinase et WD40 de LRRK2. Enfin, deux séquences candidates à la liaison avec LRRK2, dérivées d'une expérience de PEP-Scan avec PPP2CA, présentent une affinité de liaison de l'ordre du nanomolaire avec LRRK2, ce qui suggère que ces deux peptides pourraient potentiellement moduler l'interaction LRRK2:PPP2CA.Dans l'ensemble, la vérification de l'hypothèse que la promotion de la phosphorylation de LRRK2 est thérapeutique a conduit à la découverte de phénotypes de phosphorylation de LRRK2, justifiant la poursuite des travaux pour vérifier cette hypothèse. Les résultats confirment de manière robuste l'interaction physique entre LRRK2 et PPP, et identifient de courtes séquences peptidiques ayant une forte affinité de liaison pour LRRK2, qui peuvent servir de modulateurs candidats des complexes LRRK2:PPP. La présente thèse de doctorat ouvre donc la voie aux futurs tests biologiques des modulateurs de LRRK2:PPP à l'aide de résultats de nos tests de phosphophénotypage.

Résumé traduit

Mutations in Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) are linked to autosomal dominant Parkinson's disease (PD). The LRRK2 gene encodes a multiphosphorylated protein with several functional domains involved in protein-protein interaction, GTPase and kinase activity. Mutations in the catalytic core of LRRK2 that segregate with disease alter its kinase activity. Targeting LRRK2 kinase activity is widely investigated with several compounds in late preclinical and early clinical stages. Other LRRK2 functions are also under investigation for their links to PD pathomechanisms, which could serve as potential targets and disease biomarkers. Studies suggest LRRK2 phosphoregulation is pivotal to its pathological and physiological functioning. LRRK2 comprises two distinct phosphorylation sites, namely the heterologous and autophosphorylation sites. A cluster of heterologous phosphosites (S910, S935, S955, S973) show reduced phosphorylation in sporadic PD brains, in disease mutants of LRRK2 and pharmacological inhibition of LRRK2 kinase activity. The phosphorylation status of LRRK2 influences its subcellular localization. These results spurred the identification of PP1 and PP2A as the phosphatases dephosphorylating the LRRK2 heterologous sites. Our team has been focused on studying the consequences of LRRK2 dephosphorylation and the role of its phosphatases, with particular interest of modulating this interaction as a novel therapeutic approach for PD. Therefore, the present doctoral thesis aims to determine the phenotypes of LRRK2 in varying states of phosphorylation, and carry out physical and functional interaction studies between LRRK2:PPP.The results obtained in this thesis project demonstrate there is no significant alteration in the stability of the purified LRRK2 phosphomutants (S860/910/935/955/973/976 6x S>D/A) when compared to the WT. We confirm RAB29 induced hyperactivation of autophosphorylation of the phosphodead hexamutant (6xS>A). Interestingly, RAB29 expression affects total LRRK2 levels of some phosphomutants and R1441G mutant. The Drosophila melanogaster model expressing the 6xS>D form of human LRRK2 shows increased sensitivity to chloroquine induced lysosomal stress as compared to the 6xS>A and WT flies. Furthermore, a functional link between LRRK2 and PP1 catalytic subunit alpha (Ppp1CA) is shown by proteomic and immunoblot analysis of rat urinary extracellular vesicles (uEVs); a 3-fold increase of Ppp1CA is shown in uEVs of LRRK2 KO compared to WT rats. Concerning the physical interaction between LRRK2 and its phosphatases, an in vivo interaction between endogenous LRRK2 and Ppp1CA and Ppp2CA is confirmed in rat brains (using LRRK2 KO control). In addition, coIPs were performed to map the interaction between LRRK2 and PPP2CA, with contact points for PPP2CA in the Ankyrin, Kinase and WD40 domains of LRRK2. Finally, 2 candidate LRRK2 binding sequences derived from a peptide scanning experiment with PPP2CA, display a nanomolar range binding affinity with LRRK2, suggesting these 2 peptides could potentially modulate the LRRK2:PPP2CA interaction.Altogether, testing the hypothesis that promoting LRRK2 phosphorylation may be therapeutic led to the discovery of some phenotypes of LRRK2 phosphorylation, additional work is required to verify the hypothesis. The results of this doctoral thesis robustly confirm the physical interaction between LRRK2:PPP, and identify short peptide sequences with a high binding affinity for LRRK2, which may serve as candidate modulators of LRRK2:PPPcomplexes. Hence, the present doctoral thesis paves the way for the future biological testing of LRRK2:PPP modulators using readouts obtained in our phosphophenotype testing.