• Langue : Anglais
• Discipline : Chimie théorique, physique, analytique
• Identifiant : 2023ULILR070
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 07/12/2023

Résumé en langue originale

Les protéines fluorescentes réversiblement commutables (RSFP), caractérisées par une photocommutation d'un état non fluorescent (Off) à un état fluorescent (On), sont des outils précieux pour une variété d'applications en imagerie biologique, en particulier dans les microscopies de fluorescence super-résolues tel que le RESOLFT. Les propriétés photochromiques et photophysiques des RSFP, telles que les coefficients d'extinction molaire, le rendement quantique de fluorescence, la récupération thermique et le rendement quantique de photocommutation, sont essentielles car elles définissent le contraste de commutation et la résolution maximale théorique, et elles sont également liées à la luminosité, au contraste des images et à la vitesse d'acquisition des images dans ces microscopies. Dans cette thèse, nous nous concentrons sur la rsEGFP2 qui est une RSFP particulière utilisée en RESOLFT. Alors que la mutation ciblée ou aléatoire est la technique générale pour moduler les propriétés des RSFP, cette thèse démontre qu'en utilisant l'effet plasmonique, il est possible de modifier et d'optimiser les propriétés photophysiques de la rsEGFP2. Dans la littérature il existe une grande divergence en ce qui concerne les valeurs de fluorescence et de rendement quantique de commutation de rsEGFP2. Nous avons tout d'abord déterminé la dépendance de la fluorescence et du rendement quantique de commutation par rapport à la température pour rsEGFP2. Pour le rendement quantique de commutation, nous avons développé une nouvelle expérience économique pour suivre l'évolution de l'absorbance à différentes températures sous irradiation continue. En tenant compte pour la première fois de l'ensemble des paramètres influents (rendement de commutation, constantes de retour thermique, coefficient d'extinction de toutes les espèces absorbantes) et avec une évaluation précise de la marge d'erreur, nous avons déterminé les valeurs du rendement quantique de commutation On-to-Off et Off-to-On à des températures spécifiques. Nous avons constaté qu'à 37°, le retour thermique a un impact important sur les valeurs de rendement quantique. En outre, les rendements quantiques de la photocommutation On-to-Off et Off-to-On dépendent de la longueur d'onde d'irradiation et de la température, tandis que le rendement quantique de la fluorescence diminue d'environ 30 % par rapport à la température ambiante. Par conséquent, nous proposons un nouveau schéma photodynamique avec deux espèces différentes à l'état fondamental, une espèce non émissive qui contrôle la commutation On-to-Off et une espèce émissive qui contrôle la luminosité. Nous avons également calculé la dépendance de la taille et de la forme des propriétés plasmoniques de nanoparticules d'or et d'argent afin de trouver les bons candidats pour moduler la fluorescence et le rendement quantique de commutation de rsEGFP2. Le facteur clé réside dans leurs différentes propriétés de diffusion et d'absorption. Nous avons donc synthétisé des nanoparticules d'argent et des nanobatônnets d'or de 100 nm de diamètre. L'argent donne une bande SPR à 450 nm tandis qu'elle est à 540 nm pour l'or. Des études de ces nanoparticules seules ou intégrées dans un polymère (PVA) contenant le rsEGFP2 ont été réalisées. À l'aide d'un microscope FLIM, nous avons mesuré les traces temporelles d'intensité et la durée de vie de la rsEGFP2 à proximité et à distance des nanoparticules métalliques pour examiner l'effet plasmonique. Nous avons constaté que le contraste de commutation et la luminosité de la rsEGFP2 peuvent être améliorés par les nanoparticules d'argent, alors qu'aucune modification significative n'a été observée dans le cas de l'or, ce qui peut s'expliquer par le calcul du rapport entre les sections transversales de diffusion et d'absorption de la diffusion et de l'absorption. Dans l'ensemble, nos résultats ouvrent une nouvelle voie pour contrôler les propriétés photophysiques des RSFP pour l'imagerie à super-résolution.

Résumé traduit

Reversibly switchable fluorescent proteins (RSFP), characterized by a photo-switching from a non-fluorescent (Off) to a fluorescent (On) state, are valuable tools to a variety of applications in biological imaging especially in super-resolved fluorescence microscopies. The photochromic and photophysical properties of RSFPs such as molar extinction coefficients, fluorescence quantum yield, thermal back recovery and photo-switching quantum yield are essential as they impose the switching contrast and theoretical maximum resolution, and they are also linked to the brightness, contrast of images and imaging acquisition speed in these microscopies. In this thesis we focus on rsEGFP2 which is a peculiar RSFP used in the reversible saturable optical fluorescence transition (RESOLFT) method, a super-resolved microscopy technique that allows significant reduction in the illumination intensities and in photobleaching. While targeted or random mutation is the general technique to modulate properties of RSFPs, this thesis is demonstrating that using plasmonic effect and enhancement of electromagnetic field of specific metal nanoparticles, it is possible to change and optimize the photophysical properties of rsEGFP2. In literature, there is a large discrepancy about fluorescence and switching quantum yield values of rsEGFP2. In addition, these values are usually given at room temperature, which are different from the temperature setting for in-vivo studies. Therefore, we firstly determined the temperature-dependence of fluorescence and switching quantum yield temperature-dependence for rsEGFP2. For the switching quantum yield we developed a new budget-friendly experiment to follow the evolution of absorbance at different temperature under continuous irradiation. Taking into account for the first time the full set of influencing parameters, i.e., dependence of switching yield on irradiation wavelengths, influence of the thermal back recovery rate constants, the extinction coefficient of all absorbing species, and with an evaluation of robustness and error propagation, we determined On-to-Off and Off-to-On switching quantum yield values under specific temperatures. We found that at 37° the thermal recovery has a strong impact on the determination of the quantum yield values. Moreover, the photo-switching quantum yields in both On-to-Off and Off-to-On directions is dependent on irradiation wavelength and on temperature dependent with varied degrees, while the fluorescence quantum yield decrease about 30% in comparison to room temperature. Therefore, we propose a new photodynamics scheme with two different On-state ground state species, i.e., a non-emissive one that controls the On-to-Off switching and an emissive one the brightness. Then, we calculated the size and shape dependence of the plasmonic properties of gold and silver nanoparticles to find the good candidate for modulating fluorescence and switching quantum yield. The key factor behind the different outcomes by plasmonic nanoparticles lies in their different scattering and absorption properties. Based on the simulation, we synthesized 100 nm diameter silver nanoparticle and gold nanorods. The silver nanoparticle has a SPR band at 450 nm while it is at 540 nm for the gold ones. Preliminary studies of these nanoparticle alone or embedded within a polymer (PVA) containing rsEGFP2 were performed. Using a FLIM microscope, we measured the intensity time traces and lifetime of rsEGFP2 near and away from metallic nanoparticles to examine the plasmonic effect. We found that both switching contrast and the brightness of rsEGFP2 could be improved by silver nanoparticles, while no significant modification of rsEGP2 properties was observed in the case of gold nanorods which can be explained with the calculation of ratio between the scattering and absorption cross sections. Altogether our results open a new way to control RSFPs photophysical properties for super-resolution imaging.