• Langue : Français
• Discipline : Sciences de la vie et de la santé
• Identifiant : 2022ULILS056
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 27/01/2022

Résumé en langue originale

Le virus de l’hépatite E (HEV) est l’agent étiologique le plus fréquent d’hépatite aiguë dans le monde. Le nombre de cas d’hépatite E par an est estimé à 20 millions et est responsable de plus de 70 000 décès chaque année. Longtemps considéré comme un virus restreint aux pays en développement, le HEV a également été identifié dans les pays industrialisés. La transmission du HEV dans ces pays est zoonotique et le nombre de cas diagnostiqués est en constante augmentation, faisant du HEV un problème majeur de santé publique. Longtemps considéré comme un virus impossible ou difficile à étudier dans un contexte in vitro, ce n’est que très récemment que des outils biologiques permettant de dévoiler des parts d’ombre concernant le cycle infectieux du HEV ont vu le jour. Notamment, ces dernières années, des études récentes ont montré que la protéine de capside du virus, nommée ORF2, est produite sous différentes isoformes: (i) La forme ORF2i ou forme infectieuse associée au génome viral. Cette forme est non glycosylée et participe à la synthèse des virions, (ii) La forme ORF2ni, qui correspond à une fraction nucléaire de la protéine ORF2i, (iii) La forme ORF2g ou forme glycosylée et (iv) La forme ORF2c ou forme clivée issue de la forme ORF2g. Les formes ORF2g et ORF2c ne sont pas associées à du matériel infectieux. Elles sont N-glycosylées, O-glycosylées, sialylées et massivement sécrétées dans le surnageant de culture cellulaire et dans le sérum des patients infectés par le HEV. La protéine ORF2 est constituée de 660 acides aminés et possède un peptide signal N-terminal. Des données du laboratoire suggéraient que la fonctionnalité de ce peptide signal pourrait être modulée durant le cycle infectieux du HEV et réguler finement la stoechiométrie entre les différentes formes de l’ORF2. Durant ma thèse, j’ai tout d’abord étudié les mécanismes de biogenèse des isoformes de la protéine de capside ORF2. J’ai ensuite identifié et caractérisé les usines virales du HEV. Dans la première partie de mon projet de thèse, en étroite collaboration avec les membres de mon équipe, nous avons mis en place de nombreuses approches expérimentales et montré qu’un motif riche en résidus arginine (ARM) situé en amont du peptide signal de l’ORF2 est probablement la pierre angulaire du cycle infectieux du HEV. Nous avons combiné des expériences d’immunofluorescence, de microscopie confocale, de bio-informatique, de transcriptomics, de western blot, de titrage viral, de RT-qPCR, de fractionnement subcellulaire ainsi que d’expression de protéines hétérologues. Les résultats obtenus dans ce projet de thèse montrent que l’ARM sert de signal de localisation nucléaire et médie l’import nucléaire de la protéine ORF2i pour contrôler certaines fonctions cellulaires altérant probablement la réponse antivirale de la cellule infectée. La protéine ORF2 est ensuite exportée du noyau grâce à la présence de 3 sites d’exports nucléaires de l’ORF2. De manière importante, nous avons démontré que l’ARM serait le principal acteur dans la modulation de la fonctionnalité du peptide signal de l’ORF2 lors du phénomène d’adressage à la voie de sécrétion. Ce phénomène serait à l’origine de la synthèse des différentes formes de la protéine ORF2. Alors que la forme ORF2i serait adressée du côté cytosolique du RE, les formes secrétées seraient adressées du côté luminal du réticulum endoplasmique pour subir ensuite des maturations post-traductionnelles notamment des clivages assurés par des protéases de la famille des pro-protéines convertases de type Furine. Dans la deuxième partie de mon projet de thèse, nous nous sommes intéressés au devenir de la protéine ORF2i dans le cytoplasme des cellules infectées et plus particulièrement à l’identification des usines virales. Actuellement, il n’existe que très peu d’outils permettant d’étudier le HEV [...]

Résumé traduit

Hepatitis E virus (HEV) is the most common etiological agent of acute hepatitis in the world. The number of hepatitis E cases per year is estimated at 20 million and is responsible for more than 70,000 deaths each year. For a long time considered as a virus restricted to developing countries, HEV has also been identified in industrialized countries. HEV transmission in these countries is zoonotic and the number of diagnosed cases is constantly increasing, making HEV a major public health problem. For a long time considered as a virus impossible or difficult to study in an in vitro context, it is only very recently that biological tools have been developed and revealed parts of the darker side of the HEV lifecycle. In particular, in recent years, recent studies have shown that the viral capsid protein, named ORF2, is produced in different isoforms: (i) The ORF2i or infectious form associated with the viral genome. This form is non-glycosylated and participates in virion synthesis, (ii) the ORF2ni form, which corresponds to a nuclear fraction of the ORF2i protein, (iii) the ORF2g form or glycosylated form and (iv) the ORF2c form or cleaved form derived from the ORF2g form. The ORF2g and ORF2c forms are not associated with infectious material. They are N-glycosylated, O-glycosylated, sialylated and massively secreted in the cell culture supernatant and in the serum of HEV infected patients. The ORF2 protein consists of 660 amino acids and has an N-terminal signal peptide. Data from the laboratory suggested that the functionality of this signal peptide could be modulated during the HEV lifecycle and finely regulates the stoichiometry between the different forms of ORF2. During my thesis, I first studied the biogenesis mechanisms of the ORF2 capsid protein isoforms. I then identified and characterized the viral factories of HEV. In the first part of my thesis project, in close collaboration with my team members, we implemented numerous experimental approaches and showed that an arginine-rich motif (ARM) located upstream of the ORF2 signal peptide is probably the cornerstone of the HEV lifecycle. We combined immunofluorescence, confocal microscopy, bioinformatics, transcriptomics, western blot, viral titration, RT-qPCR, subcellular fractionation and heterologous protein expression experiments. The results obtained in this project show that the ARM serves as a nuclear localization signal and mediates the nuclear import of the ORF2i protein to control certain cellular functions that probably alter the antiviral response of the infected cell. The ORF2 protein is then exported from the nucleus through the presence of 3 nuclear export sites of ORF2. Importantly, we have shown that the ARM is a key player in modulating the functionality of the ORF2 signal peptide during addressing to the secretory pathway. This phenomenon leads the synthesis of the different ORF2 forms. While the ORF2i form is addressed on the cytosolic side of the ER, the secreted forms are addressed on the luminal side of the endoplasmic reticulum and then undergo post-translational maturation, in particular cleavages by proteases from the proprotein convertase family, such as Furin. In the second part of my thesis project, we focused on the fate of the ORF2i protein in the cytoplasm of infected cells and more particularly on the identification of viral factories. Currently, there are very few tools to study HEV. Therefore, we generated antibodies specifically recognizing the different forms of ORF2. We generated three antibodies directed against ORF2i and one antibody recognizing the ORF2i/g/c forms [...]