• Langue : Anglais
• Discipline : Biochimie et biologie moléculaire
• Identifiant : 2022ULILS043
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 09/11/2022

Résumé en langue originale

Le Hepatocyte-nuclear-factor-1-alpha (HNF1A) est un facteur de transcription clé qui régule l'expression de nombreux gènes impliqués dans plusieurs processus métaboliques, notamment dans le foie, l'intestin, le rein et le pancréas. Les mutations hétérozygotes du gène HNF1A sont à l'origine de la forme la plus fréquente de diabète monogénique appelée "Maturity-onset-diabetes-of-the-young" (MODY),communément appelée HNF1A-MODY. Les porteurs de la mutation HNF1A-MODYdéveloppent une légère hyperglycémie dans l'enfance et un diabète plus tard dans la vie en raison d'une perte progressive de la fonction des cellules bêta. Cependant,comme HNF1A n'est pas seulement exprimé dans les cellules bêta du pancréas, mais aussi dans les cellules alpha et delta, ce projet de thèse a été réalisé pour étudier l'effet de la déficience en HNF1A sur la sécrétion paracrine intra-îlot, accompagnée d'altérations dans les gènes codant pour les protéines qui contrôlent l'absorption et le métabolisme du glucose. Pour ce faire, j'ai utilisé des modèles cellulaires et murins de diabète HNF1A-MODY. Le premier modèle cellulaire que j'ai utilisé était la lignée cellulaire INS-1 d'insulinome de rat dérivée de cellules bêta pour surexprimer conditionnellement la mutationP291fsinsC du gène HNF1A (HNF1A-P291fsinsC), en utilisant un système de transactivateur inverse dépendant de la tétracycline. L'expression de la protéine mutante P291fsinsC a été maximalement induite à un niveau significatif par rapport à celle de la Hnf1a endogène en traitant les cellules avec 500 ng/ml de doxycycline pendant (2 à 72 heures). Les cellules INS-1 non induites ont servi de contrôle. Les cellules INS-1 ayant été précédemment signalées comme étant bi-hormonales et n'exprimant pas de marqueurs de cellules alpha, j'ai utilisé ce modèle pour étudier l'effet de la mutation HNF1A-P291fsinsC sur l'expression et la sécrétion des gènes et des protéines de l'insuline et du glucagon. Les analyses cytométriques et d'immunofluorescence ont révélé que les cellules INS-1 étaient principalement composées de cellules insulino-positives, alors que seules quelques cellules coexprimaient l'insuline et le glucagon. Cependant, les cellules bêta matures et immatures ont sécrété de l'insuline et du glucagon en réponse à la stimulation par le glucose. De plus, la surexpression de la protéine mutante HNF1A-P291fsinsC a augmenté l'expression du peptide dérivé du proglucagon et la sécrétion de glucagon en réponse à une stimulation à haute teneur en glucose par rapport aux cellules INS-1 non induites. Ces résultats suggèrent que la protéine Hnf1A est essentielle pour maintenir la maturation et la fonction des cellules bêta.Bien que les cellules INS-1 soient un outil pour étudier la fonction des cellules bêta,elles ne ressemblent pas aux cellules des îlots humains en termes de signalisation paracrine. J'ai donc développé un modèle in vitro en transfectant des îlots humains avec des siRNA ciblant HNF1A (siHNF1A). J'ai utilisé des îlots déficients en HNF1Apour étudier ses effets sur le transport du glucose et la sécrétion hormonale,simultanément à partir des mêmes préparations d'îlots de donneurs. Les transfections de siHNF1A ont réduit de manière significative les niveaux de protéine HNF1A par rapport aux contrôles brouillés, observés par analyse Western Blot. siHNF1A a également réduit l'expression et la sécrétion de la protéine insuline en réponse à une stimulation à haute teneur en glucose. Cela a coïncidé avec une réduction des niveaux de protéine SGLT2, sans changement pour SGLT1, mais avec une légère diminution pour GLUT2. La diminution du SGLT2 était également associée à une augmentation significative de l'expression et de la sécrétion de la protéine glucagon. Ces résultats ont mis en évidence que HNF1A est également un régulateur clé de la fonction des cellules alpha [...]

Résumé traduit

Hepatocyte-nuclear-factor-1-alpha (HNF1A) is a key transcription factor that regulates the expression of numerous genes involved in several metabolic processes such as in the liver, intestine, kidney, and pancreas. Heterozygous mutations in the HNF1A gene causes the most frequent form of monogenic diabetes called Maturity-onset-diabetes-of-the-young (MODY), commonly referred to as HNF1A-MODY. HNF1A-MODY mutation carriers develop mild-hyperglycemia in childhood and diabetes later in life due to a progressive loss of beta cell function. However, since HNF1A is not only expressed in pancreatic beta cells, but also in alpha and delta cells, this thesis project was carried out to study the effect of HNF1A deficiency on intra-islet paracrine secretion, accompanied by alterations in genes encoding proteins that control glucose uptake and metabolism. To do so, I used cellular and mouse models of HNF1A-MODYdiabetes.The first cellular model I used was the beta-cell-derived rat insulinoma INS-1 cell line to conditionally overexpress the frameshift P291fsinsC mutation in the HNF1A gene(HNF1A-P291fsinsC), using a reverse tetracycline-dependent transactivator system. The expression of the P291fsinsC mutant protein was maximally induced to a significant level over that of endogenous Hnf1a by treating the cells with 500 ng/ml of doxycycline for (2 to 72 hrs). Non-induced INS-1 cells served as a control. Since INS-1 cells were previously reported to be bi-hormonal and did not express alpha cellmarkers, I utilized this model to study the effect of the HNF1A-P291fsinsC mutation on insulin and glucagon gene and protein expression and secretion. Cytometric and immunofluorescence analysis revealed that INS-1 cells comprised mostly of insulinpositivecells, whereas only a few cells co-expressed insulin and glucagon. However,both mature and immature beta cells secreted insulin and glucagon in response to glucose stimulation. Moreover, the overexpression of the HNF1A-P291fsinsC mutant protein increased proglucagon-derived peptide expression and glucagon secretion inresponse to high-glucose stimulation compared to non-induced INS-1 cells. These findings suggest that Hnf1A is essential to maintain beta cell maturation and function.Although INS-1 cells are a valuable tool to study beta-cell function, they do not resemble human islet cells in terms of paracrine signaling. Therefore, I developed an in vitro model by transfecting human islets with siRNAs targeting HNF1A (siHNF1A). I used islets deficient in HNF1A to investigate its effects on glucose transport and hormone secretion, simultaneously from the same donor islet preparations. siHNF1A transfections significantly decreased HNF1A protein levels compared to scrambled controls, observed by Western Blot analysis. siHNF1A also reduced insulin protein expression and secretion in response to high-glucose stimulation. This coincided with reduction in SGLT2 protein levels, with no changes in SGLT1, but a slight decrease inGLUT2. The decrease in SGLT2 was also associated with a significant increase inglucagon protein expression and secretion. These findings highlighted that HNF1A is also a key regulator of alpha cell function.Two HNF1A-MODY mouse models have previously been developed to study the pathogenesis of HNF1A-MODY in vivo. The first was a global Hnf1a-/- knock-out (KO) mouse and the second was a transgenic mouse that overexpresses the dominant-negative human mutant protein specifically in pancreatic beta cells, under the rat insulin promoter [...]