• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Biotechnologies agroalimentaires, sciences de l'aliment, physiologie
• Identifiant : 2022ULILR077
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 20/12/2022

Résumé en langue originale

RésuméL'objectif de cette thèse était de rechercher de nouvelles enzymes de dégradation de la lignine à partir de souches de champignons issus de milieux naturels. Des prélèvements ont été effectués sur du bois dans trois écosystèmes différents : une forêt de feuillus (hêtre, bouleau) et résineux (cyprès Lambert), un cep de chardonnay attaqué par la maladie du bois de la vigne et enfin une souche en décomposition sur un parking d'une zone urbaine. 71 souches de champignons ont été isolées à partir de ces prélèvements. Pour connaître les souches produisant des enzymes d'intérêt, un criblage d'activité ligninolytique a été effectué. Afin de rendre ce criblage le plus exhaustif possible, différentes conditions de culture ont été mises en place. Trois milieux de cultures avec des éléments inducteurs spécifiques ont été testés afin de stimuler la production d'enzymes ligninolytiques par les champignons. Les trois milieux de culture utilisés pour le criblage furent donc un milieu riche sans induction, un milieu avec de la paille de blé et un autre avec du gaïacol. De même, pour prendre en compte l'aspect cinétique de production des enzymes par les champignons, deux temps de mesure à 7 et 14 jours ont été observés. Ce criblage a permis de sélectionner 15 champignons présentant au moins une activité enzymatique d'intérêt. Sur ces 15 champignons, deux souches ont produit leurs activités ligninolytiques seulement sur les milieux contenant un inducteur. Parmi ces 15 champignons, deux basidiomycètes ainsi que 13 ascomycètes appartenant à 6 genres différents ont été identifiés. 12 ascomycètes étaient déjà décrits dans la littérature pour produire des enzymes de type laccase, Lip et Mnp. Les deux basidiomycètes, Peniophora versicolor et Piptoporus betulinus n'étaient pas connus pour cette activité ligninolytique. En outre, l'ascomycète Scedosporium apiospermum a montré une activité de type laccase lors du criblage. Des expérimentations de dégradation de la lignine ont pu déterminer que les enzymes présentes dans le surnageant de culture de ce champignon, possèdent une activité de modification du polymère de lignine. S. apiospermum a donc été sélectionné afin de caractériser ses enzymes de type laccase, détectées lors du criblage. Grâce à un criblage in silico dans le génome de S. apiospermum, neuf gènes putatifs de laccase ont été détectés. Après avoir généré une librairie d'ADNc, cinq gènes putatifs de laccase ont été amplifiés puis clonés avec succès dans la levure Yarrowia lipolytica. Dans les conditions de l'étude, deux gènes Lac2 et ITMO2 permirent d'obtenir des enzymes recombinantes actives. Dans leur structure primaire, les enzymes Lac2 et ITMO2 présentent chacune les sites de coordination du cuivre, spécifiques des oxydases à cuivre. Lac2 et ITMO2 possèdent un pH optimum de 3 et 5 respectivement. Les deux enzymes ont démontré qu'elles possèdent une activité d'oxydation sur des substrats phénoliques comme le 2.6 dimétoxyphénol, le pyrogallol et la dopamine, mais aussi sur des substrats non phénoliques comme le 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) et l'o-Dianisidine.

Résumé traduit

AbstractThe goal of this thesis was to search for new fungal ligninolytic enzymes from the environment. Samples of woody biomass were collected in three different ecosystems: a forest composed of deciduous trees (beech, birch) and gymnosperm (Cupressus macrocarpa), a cep of chardonnay infected with grapevine trunk disease and finally a decaying tree stump in a parking lot of an urban area. 71 strains were isolated from these environments. To select the fungal strain able to produce enzymes of interest a screening for laccase, Lip and Mnp was carried out. In order to maximize the completeness of this screening different culture conditions were used. To trigger the production of ligninolytic enzymes by the fungi Three culture media supplemented or not with inductors were used for the screening. The first medium tested was a rich medium without induction. The two other media contained respectively wheat straw and guaiacol as inductors. Besides, sampling was performed after 7 and 14 days as the kinetics of enzyme production could vary for a given fungal strain and culture conditions. 71 strains were tested for ligninolytic activities and 15 of them presented at least one enzymatic activity. Two of them showed their ligninolytique activities only on the media with inductors. Among the 15 fungi with enzymatic activities of interest, two basidiomycetes and 13 ascomycetes belonging to 6 different genera were identified. 12 ascomycetes were already described in the literature with laccase, Lip or Mnp activity. To our knowledge, the two basidiomycetes Peniophora versicolor and Piptoporus betulinus were not described for producing ligninolytic activities. Besides Scedosporium apiospermum showed laccase activity during the screening. Experiments of lignin degradation were carried out with the culture supernatant of this fungus. The results showed that the enzymes contained in S. apiospermum were able to modify the lignin polymer. This fungus was thus selected to further characterize its laccase like enzymes detected by the screening. Thanks to an in-silico screening in the genome of S. apiospermum 9 putative laccase genes were detected. Five putative laccase genes were then amplified with success from a cDNA library obtained from the mRNA of the fungus. Those five genes were cloned in the yeast Yarrowia lipolytica. In the conditions of the study, two genes called Lac2 and ITMO2 allowed the production of two active enzymes. In their primary structure, the two enzymes present the characteristic sites of copper coordination of multicopper oxidases. Lac2 and ITMO2 present an optimum pH of 3 and 5 respectively. Those two enzymes show an oxidative activity on various phenolic substrates such as 2.6 dimetoxyphenol, pyrogallol and dopamine but also on non-phenolic substrates including 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and o-Dianisidine.