• Langue : Anglais
• Discipline : Chimie organique, minérale, industrielle
• Identifiant : 2021LILUR067
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 08/12/2021

Résumé en langue originale

La paroi cellulaire de la levure est l'organite le plus externe de la cellule de la levure. Elle est composée d'une couche interne de polysaccharides, constituée de β-glucannes majoritairement réticulés à une quantité mineure de chitine, et à laquelle sont liées des mannoprotéines par des liaisons covalentes ou non. Les mannoprotéines forment la couche externe de la paroi cellulaire de la levure et sont considérées comme son deuxième composant le plus abondant. Les mannoprotéines de la paroi cellulaire de la levure sont des protéines fortement mannosylées par des O- glycannes simples courts et par des N-glycannes complexes et longs. Elles présentent des propriétés fonctionnelles particulières et une valeur nutritionnelle exceptionnelle liées à leur structure moléculaire, mais ont été peu étudiées. Ce travail vise à étudier la structure moléculaire des mannoprotéines de la paroi cellulaire de la levure par différentes techniques basées sur la spectrométrie de masse haute résolution.Les mannoprotéines ont été extraites par des procédés physiques ou chimiques, couplés éventuellement à un traitement enzymatique de la souche de référence S288C cultivées selon différents modes dans des bioréacteurs en présence d’un milieu de culture, ou d'échantillons levure industrielle, ou de produits industriels déjà fractionnés de levure. Ensuite, ces mannoprotéines ont été O- et N-déglycosylées chimiquement ou enzymatiquement. Les peptides obtenus ont été analysés par nanoESI-LC-MS/MS. L’analyse bio-informatique de ces données a permis l'identification et la quantification des mannoprotéines grâce à la base de données de la souche de référence de Saccharomyces cerevisiae S288C. La déglycosylation des peptides a également été vérifiée. Une analyse de l'ontologie des gènes a été ensuite réalisée pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines identifiées. Les O- et N-glycannes ont été chimiquement dérivées par une réaction d’amination réductrice, puis analysées respectivement par µESI-LC-MS et électrophorèse capillaire.Ce travail nous a permis de comparer différentes méthodes d'extraction des mannoprotéines de la paroi cellulaire de levure. Ces méthodes entraînent un enrichissement qualitatif ou quantitatif de différents types de ces mannoprotéines, mais aussi conduisent à la présence d'autres protéines principalement annotées comme étant liées aux membranes des organelles (en particulier mitochondriales et nucléaires). Une purification supplémentaire des isolats de paroi a été appliquée pour réduire le nombre de ces protéines n’appartenant pas à la paroi. Le développement d’un protocole de N-déglycosylation enzymatique utilisant une méthode utilisant un seul contenant sans transfert de l’échantillon a permis l'augmentation de la couverture des mannoprotéines identifiées. Avec d’autres enzymes le même protocole permet une O-déglycosylation douce mais qui dégrade les O-glycannes en monosaccharides. La N-déglycosylation enzymatique combinée avec une O-déglycosylation chimique permet d’isoler simultanément les O- et N-glycannes des mannoprotéines, permettant leur analyse ultérieure par spectrométrie de masse et électrophorèse capillaire après modification chimique avec des marqueurs appropriés par réaction d'amination réductrice. Les profils de protéines diffèrent qualitativement et quantitativement selon la phase de croissance et le mode de culture. Nous avons identifié certains de leurs marqueurs protéiques, qui sont des marqueurs de la privation de glucose exprimée dans la phase de croissance stationnaire de la culture discontinue en lot et de la culture discontinue alimentée.Cette approche glycoprotéomique a également été appliquée à la caractérisation glycoprotéomique et peptidomique des produits générés par différentes méthodes de traitement industriel, destinés à un usage commercial, permettant de déchiffrer leur nature complexe en termes de composition et de structure.

Résumé traduit

Yeast cell wall is the outermost organelle of the yeast cell. It composed of an inner layer of polysaccharides, consisting of β-glucans mostly cross-linked to a minor amount of chitin, and to which are linked mannoproteins by covalent or non-covalent bonds. Mannoproteins form the outer layer of the yeast cell wall and are considered as its second most abundant component. Yeast cell wall mannoproteins are proteins that are highly mannosylated by short simple O-glycans and by large complex N-glycans. They have particular functional properties and exceptional nutritional value related to their molecular structure, but have been little investigated. This work aims to study yeast cell wall mannoproteins at the molecular level by different techniques based on high resolution mass spectrometry.The mannoproteins were extracted by physical, chemical methods eventually coupled to enzymatic methods from the reference strain S288C grown in different modes in bioreactors in the presence of a culture medium, or from industrial yeast samples, or from already fractionated industrial yeast products. These mannoproteins were then O- and N-deglycosylated chemically or enzymatically. The resulting peptides were analyzed by nanoESI-LC-MS/MS. Bioinformatics analysis of these data allowed the identification and quantification of mannoproteins using Saccharomyces cerevisiae S288C reference strain database. The deglycosylation of the peptides was also verified. Gene ontology analysis was then performed to determine the subcellular location of the identified proteins. The O- and N-glycans were chemically derivatized by a reductive amination reaction and then analyzed by µESI-LC-MS and capillary electrophoresis respectively.This work allowed us to compare different methods of extraction of mannoproteins from the yeast cell wall. These different methods result in qualitative or quantitative enrichment of different types of mannoproteins and in the presence of other proteins mainly annotated as being related to organelle membranes (especially mitochondrial and nuclear). Further purification of wall isolates was applied to reduce the number of these non-cell wall proteins. The development of an enzymatic N-deglycosylation protocol using a one-pot method without sample transfer allowed an increase in the coverage of identified mannoproteins. Using other enzymes, the same protocol allows a gentle O-deglycosylation but degrades O-glycans into monosaccharides. Enzymatic N-deglycosylation combined to chemical O-deglycosylation allows the simultaneous isolation of O- and N-glycans from mannoproteins, allowing their subsequent analysis by mass spectrometry and capillary electrophoresis after chemical derivatization with appropriate labels by reductive amination reaction. The protein profiles differ qualitatively and quantitatively according to the growth phase and culture mode. We identified some of their protein markers, which are markers of glucose deprivation expressed in the stationary growth phase of batch and fed batch culture.This glycoproteomic approach was also applied to the glycoproteomic and peptidomic characterization of products generated by different industrial processing methods, intended for commercial use, allowing to decipher their complex nature in terms of composition and structure.