• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Biotechnologies agroalimentaires, sciences de l'aliment, physiologie
• Identifiant : 2021LILUR060
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 16/12/2021

Résumé en langue originale

L’usage abusif et excessif des antibiotiques a exacerbé le phénomène d’antibiorésistance, à travers la planète. Aujourd’hui, la lutte contre l’antibiorésistance est devenue une priorité mondiale en matière de santé publique. En effet, chaque année, elle est responsable de plus de 700,000 décès dans le monde et d'ici 2050, elle causera plus de 10 millions de décès par an, si des actions concrètes ne sont pas mises en place afin de freiner le développement de ce phénomène. En plus des pertes humaines, le coût financier des soins afférents à l’antibiorésistance pourra atteindre 100,000 milliards de dollars dans le monde. Pour faire face à cette crise annoncée, plusieurs stratégies innovantes, parmi lesquelles l’usage des peptides antimicrobiens (PAMs), ont été proposées. Dans cette perspective, les bactériocines, qui sont des PAMs synthétisés par voie ribosomique pourraient contribuer à la solution thérapeutique. Récemment, la souche Lacticaseibacillus paracasei CNCM I-5369 s’est particulièrement distinguée pour son activité contre des germes pathogènes à Gram-négatif. Cette activité est due à 5 nouvelles bactériocines codées par des gènes chromosomiques orf010, orf012, orf023, orf030 et orf038. Toutefois, l’activité est pH-dépendante, c’est-à-dire qu’elle est exercée, uniquement à une valeur de pH ≤ 5. Dans le cadre de cette thèse, nous avons dans un premier temps, vérifiée l’expression de ces gènes lors de la croissance de la bactérie, en utilisant la technique de qPCR. Ainsi, nous avons observé que ces 5 gènes sont exprimés après 24 h de croissance, de façon concomitante à l’apparition de l’activité antimicrobienne indiquant ainsi un lien entre l’expression génique et la production des cinq bactériocines. Ces 5 bactériocines ont été exprimées en système hétérologue chez Escherichia coli Rosetta. Seule la bactériocine codée par orf030, appelée lacticaséicine 30, a pu être produite en grande quantité, contrairement aux autres bactériocines qui ont été produites mais demeurent piégées dans la fraction insoluble. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la relation entre la structure de la lacticaséicine 30 et son activité contre les bactéries à Gram-négatif. Les prédictions de structure ont suggéré une organisation en 5 hélices  de la lacticaséicine 30. La proportion d’hélice-α était plus importante à pH 5 qu’à pH 7. Pour identifier les régions impliquées dans l’activité contre les bactéries à Gram-négatif, nous avons produit des peptides dérivés de la lacticaséicine 30 par une approche de biologie moléculaire. Ces peptides dérivés sont obtenus en réduisant leurs tailles, ou en insérant des mutations ciblées dans différentes régions. Ainsi, nous avons généré des formes plus courtes de la lacticaséicine 30, contenant soit sa région N-terminale (acides aminés 1 à 39), soit les régions centrale et C-terminale (acides aminés 40 à 111). De la même manière, un peptide dérivé contenant uniquement la première hélice de la région N-terminale a été également produite. Les mutations introduisant des substitutions des acides aminés ont été introduites au sein des hélices-α. Au regard de leurs activités, ces peptides dérivés ont permis de localiser l’activité antibactérienne essentiellement dans la région N-terminale, et nécessite à minima deux hélices-α. Par ailleurs, l’activité de ces variants peptidiques E32G, T33P, T52P et D57G reste sensiblement identique, contrairement à celles des variants E6G, T7P, D57G T52P, A74P, Y78S, Y93S et A97P qui ont été significativement altérées. Dans la dernière partie, nous avons testé l’activité de la lacticaséicine 30 contre un panel de souches cliniques à Gram-négatif et portant des résistances à la colistine. Les résultats obtenus ont mis en lumière une synergie entre la lacticaséicine 30 et la colistine et la réduction significative de l’expression des gènes mcr-1 et mcr-9, responsables de la résistance à la colistine.

Résumé traduit

The excessive use of antibiotics has exacerbated the phenomenon of antibiotic resistance throughout the world. Today, the fight against antibiotic resistance has become a global public health priority. Indeed, every year, it is responsible for more than 700,000 deaths in the world and by 2050, it will cause more than 10 million deaths per year, if concrete actions are not implemented to curb the development of this phenomenon. In addition to the human losses, the financial cost of antibiotic resistance-related care could reach 100,000 billion dollars worldwide. To face this crisis, several innovative strategies, including the use of antimicrobial peptides (AMPs), have been proposed. In this perspective, bacteriocins, which are ribosomally APMs, could contribute to the therapeutic solution. Recently, the Lacticaseibacillus paracasei CNCM I-5369 strain has been particularly distinguished for its activity against Gram-negative pathogens. This activity is due to 5 new bacteriocins encoded by chromosomal genes orf010, orf012, orf023, orf030 and orf038. However, the activity is pH-dependent, i.e., it is exerted, only at a pH value ≤ 5. In the framework of this thesis, we first verified the expression of these genes during the growth of the bacteria, using the qPCR technique. Thus, we observed that these 5 genes were expressed after 24 h of growth, concomitantly with the appearance of antimicrobial activity indicating a possible link between gene expression and the production of the five bacteriocins. These 5 bacteriocins were expressed in a heterologous system in Escherichia coli Rosetta. It should be noted that only the bacteriocin encoded by orf030, called lacticaseicin 30, could be produced in large quantities, in contrast to the other bacteriocins which were produced but remain trapped in the insoluble fraction. In a second step, we investigated the relationship between the structure of lacticaseicin 30 and its activity against Gram-negative bacteria. Structural predictions suggested a 5-helix organization of lacticaseicin 30. The proportion of helix-α was greater at pH 5 than at pH 7. To identify the regions involved in the activity against Gram-negative bacteria, we produced lacticaseicin 30-derived peptides by a molecular biology approach. These derived peptides are obtained by reducing their sizes, or by inserting targeted mutations in different regions. Thus, we generated shorter forms of lacticaseicin 30, containing either its N-terminal region (amino acids 1 to 39), or the central and C-terminal regions (amino acids 40 to 111). Similarly, a derivative peptide containing only the first helix of the N-terminal region was also produced. Mutations introducing amino acid substitutions were introduced within the α-helices. With regard to their activities, these derived peptides localized antibacterial activity mainly in the N-terminal region, and requires at least two helix-αs. Furthermore, the activity of these peptide variants E32G, T33P, T52P, and D57G remained essentially the same, unlike to those of the variants E6G, T7P, D57G T52P, A74P, Y78S, Y93S, and A97P, which were significantly impaired. In the last part, we tested the activity of lacticaseicin 30 against a panel of Gram-negative clinical strains with colistin resistance. The results obtained highlighted a synergy between lacticase 30 and colistin and a significant reduction of the expression of the mcr-1 and mcr-9 genes, responsible for colistin resistance.