• Langue : Français
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2020LILUS109
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 14/12/2020

Résumé en langue originale

La pomme de terre est une plante de la famille des solanacées qui est cultivée pour ses tubercules. Cet organe de réserve constitue un aliment de base pour de nombreuses populations dans le monde. Il est riche en amidon, un polysaccharide stocké sous forme de grains insolubles dans des organites spécialisés : les amyloplastes. Le métabolisme de l’amidon est complexe et finement régulé par de nombreuses enzymes dont les amidon-synthases. Ces enzymes sont responsables de la création de nouvelles liaisons O-glucosidiques de type α-1,4. Plusieurs isoformes d’amidon-synthases ont déjà été caractérisées chez les plantes (GBSS, SS1, SS2, SS3, SS4 et SS5). De plus, une nouvelle isoforme nommée SS6 (Starch Synthase 6) a récemment été identifiée au laboratoire par analyse protéomique chez la pomme de terre. La génomique fonctionnelle chez la pomme de terre était, jusqu’à récemment, limitée par le caractère tétraploïde et le mode de reproduction uniquement végétatif des variétés cultivées. L’émergence récente de la mutagenèse dirigée et en particulier du système CRISPR/Cas9 lève cette barrière en permettant notamment l’inactivation ciblée de gènes.Dans un premier temps, nous avons séquencé le génome de la variété de pomme de terre tétraploïde Désirée. Cette analyse a révélé un fort polymorphisme intrinsèque. J’ai utilisé ces données pour établir la cartographie des polymorphismes et mettre au point un outil d’assistance au design des cibles lors de l’édition génomique de la pomme de terre. J’ai ensuite caractérisé l’amidon issu de plantes préalablement mutées au locus GBSS par CRISPR/Cas9 et mis en évidence une accumulation de SS2 et GWD dans l’amidon. En conséquence, les contenus en phosphate, notamment en position C6 des résidus de glucose, sont augmentés. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du métabolisme et de l’assemblage des enzymes avec les polysaccharides de l’amidon.Nous avons par ailleurs montré que SS6 est présente chez les dicotylédones à l’exception des Brassicaceae. La version recombinante de la protéine de pomme de terre exprimée chez E.coli est active sur le glycogène et permet l’allongement des glucanes de DP2 à DP5. De plus, la protéine fusionnée avec la GFP et exprimée in planta est localisée dans l’amyloplaste, confirmant les observations initialement faites au laboratoire lors de la caractérisation du protéome associé à l’amidon de pomme de terre. J’ai étudié la fonction de SS6 in planta en produisant des lignées KO pour le gène correspondant par CRISPR/Cas9 et en surexprimant la protéine native sous contrôle du promoteur 35S. La surexpression du gène provoque une diminution du diamètre moyen des grains d’amidon au stade tardif du développement des tubercules suggérant que l’enzyme intervient dans la régulation de la taille et donc supposément du nombre de grains d’amidon. Nous avons de plus observé de légères modifications de la structure de l’amidon dans les lignées knock-out ss6-. En effet, l’amylopectine des lignées mutantes présente une diminution des glucanes de DP6 à DP14 et une augmentation des glucanes de DP15 à DP21. Bien que subtiles, ces modifications corroborent l’activité observée avec la protéine recombinante in vitro. L’inactivation de SS6 pourrait être partiellement compensée par l’activité d’autres amidon-synthases redondantes, comme ceci fut observé dans de nombreux cas et chez de nombreuses espèces. La production de combinaisons de mutations pour SS6 et les autres gènes amidon-synthases permettra de mieux comprendre le rôle de cette enzyme dans le métabolisme de l’amidon de réserve.

Résumé traduit

The potato is a plant of the solanaceae family that is cultivated for its tubers. This reserve organ is a staple food for many populations around the world. It is rich in starch, a polysaccharide stored in the form of insoluble granules in specialized organelles: the amyloplasts. Starch metabolism is complex and finely regulated by many enzymes including starch synthases. These enzymes are responsible for creating new α-1,4-type O-glucosidic bonds. Several isoforms of starch synthases have already been characterized in plants (GBSS, SS1, SS2, SS3, SS4 and SS5). In addition, a new isoform called SS6 (Starch Synthase 6) has recently been identified in the laboratory by proteomic analysis in potato. Functional genomics in potato were, until recently, limited by the tetraploid character and the uniquely vegetative mode of reproduction of cultivated varieties. The recent emergence of site-directed mutagenesis and in particular of the CRISPR/Cas9 system removes this barrier, in particular allowing the targeted inactivation of genes.First, we sequenced the genome of the tetraploid potato variety Désirée. This analysis revealed a strong intrinsic polymorphism. I used this data to map polymorphisms and to develop a target design assistance tool in potato genomic editing. I then characterized the starch from plants previously mutated at the GBSS locus by CRISPR/Cas9 and demonstrated an accumulation of SS2 and GWD in the starch. Consequently, the phosphate contents, in particular at the C6 position of the glucose residues, are increased. These results open new perspectives in understanding the metabolism and assembly of enzymes with starch polysaccharides.We have also shown that SS6 is present in dicotyledons except Brassicaceae. The recombinant version of the potato protein expressed in E.coli is active on glycogen and allows the elongation of glucans from DP2 to DP5. In addition, the protein fused with GFP and expressed in planta is localized in the amyloplast, confirming the observations initially made in the laboratory during the characterization of the proteome associated with potato starch. I studied the function of SS6 in planta by producing KO lines for the corresponding gene by CRISPR/Cas9 and by overexpressing the native protein under the control of the 35S promoter. Overexpression of the gene causes a decrease in the mean diameter of the starch grains at the late stage of tuber development suggesting that the enzyme is involved in the regulation of the size and therefore supposedly the number of starch grains. We also observed slight changes in starch structure in the ss6- knockout lines. Indeed, the amylopectin of the mutant lines shows a decrease in glucans from DP6 to DP14 and an increase in glucans from DP15 to DP21. Although subtle, these changes corroborate the activity observed with the recombinant protein in vitro. Inactivation of SS6 may be partially offset by the activity of other redundant starch synthases, as has been observed in many cases and in many species. The generation of combinations of mutations for SS6 and other starch synthase genes will provide insight into the role of this enzyme in the metabolism of starch storage.