• Langue : Anglais
• Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Identifiant : 2020LILUS101
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 17/07/2020

Résumé en langue originale

L'importance biologique de la glycosylation pour la santé et la maladie est largement reconnue. Les structures tronquées à terminaison mannose consistant en 1 à 3 résidus de mannose, deux N-acétylglucosamines et un nombre variable de fragments fucose sont appelées paucimannose. Les N-glycanes paucimannosidiques sont abondamment exprimés dans les plantes et les invertébrés. Cependant, chez les vertébrés, leur présence est limitée à certaines conditions pathophysiologiques, telles que le cancer, les troubles immunitaires, les infections et l'inflammation, et chez les individus en bonne santé, ils ne sont détectables qu'en quantités infimes. Il a été démontré que le Mannitou, un anticorps monoclonal murin, reconnaît spécifiquement les glycoépitopes de paucimannose.Une tentative de caractérisation de la structure de Mannitou IgM a été faite en appliquant des techniques de modélisation d'homologie, de microscopie cryoélectronique et de cristallisation. L'anticorps complet de Mannitou a été généré en utilisant la technologie des hybridomes. Le Fab recombinant de Mannitou a été exprimé avec succès de manière transitoire dans des cellules HEK293T. La spécificité de liaison de Mannitou envers différents N-glycanes de paucimannose ont été élucidées par une combinaison de méthodes expérimentales. Le criblage par microréseau a révélé que le glyco-épitope minimal était Man2GlcNAc2. À son tour, Man3GlcNAc2 a manifesté l'une des interactions les plus fortes avec l'anticorps Mannitou. Des études de reconnaissance moléculaire, utilisant des mesures de résonance plasmonique de surface et une calorimétrie de titrage isotherme, ont établi une affinité de liaison micromolaire de l'anticorps Mannitou envers le glycane Man3GlcNAc2. La cartographie de l'épitope de liaison par résonance magnétique nucléaire de transfert de saturation a démontré que Manα1-3 est le principal résidu impliqué dans la reconnaissance des anticorps de Mannitou. La régulation positive des N-glycanes paucimannosidiques dans des conditions physiopathologiques fait de l'anticorps Mannitou un outil diagnostique et thérapeutique prometteur.Pour déterminer la structure minimale des glycanes requise pour mimer l'activité antigénique du polysaccharide MenX natif, des études de résonance plasmonique de surface ont été réalisées. Les expériences ont consisté à étudier les interactions de liaison entre un anticorps anti-MenX et des oligosaccharides capsulaires du sérogroupe X de Neisseria meningitides de différentes longueurs. Les résultats suggèrent que la portion minimale de saccharide capable d'assurer une protection contre les infections à MenX pourrait être DP5, ce qui en fait un candidat prometteur pour le développement de vaccins.

Résumé traduit

The biological importance of glycosylation in health and disease is broadly acknowledged. The truncated, mannose-terminating structures consisting of 1–3 mannose residues, two N-acetylglucosamines, and a variable number of fucose moieties are termed paucimannose. Paucimannosidic N-glycans are abundantly expressed in plants and invertebrates. However, in vertebrates their presence is restricted to some pathophysiological conditions, such as cancer, immune disorders, infections, and inflammation, and in healthy individuals, they are detectable only in trace amounts. Mannitou, a murine monoclonal antibody, has been demonstrated to specifically recognise paucimannose glycoepitopes. An attempt to characterise Mannitou IgM structure was made by applying homology modelling, cryo-electron microscopy, and crystallisation techniques. Full-length Mannitou antibody has been generated using hybridoma technology. Recombinant Mannitou Fab has been successfully transiently expressed in HEK293T cells. The binding specificity of Mannitou towards different paucimannose N-glycans have been unravelled by a combination of experimental methods. The microarray screening revealed the minimal glyco-epitope to be Man2GlcNAc2. In turn, Man3GlcNAc2 manifested one of the strongest interactions with Mannitou antibody. Molecular recognition studies, employing surface plasmon resonance measurements and isothermal titration calorimetry, established a micromolar binding affinity of Manniotu antibody towards Man3GlcNAc2 glycan (Kd = ~50 μM). The mapping of the binding epitope by saturation transfer difference nuclear magnetic resonance demonstrated Manα1-3 as the main residue involved in Mannitou antibody recognition. The upregulation of paucimannosidic N-glycans in pathophysiological conditions makes Mannitou antibody a promising diagnostic and therapeutic tool.For determining the minimal carbohydrate structure required for mimicking the antigenic activity of the native MenX polysaccharide, surface plasmon resonance studies were performed. The experiments involved studying the binding interactions between an anti-MenX antibody and Neisseria meningitides serogroup X capsular oligosaccharides of different length. The results suggest that the minimal saccharide portion capable of ensuring protection against MenX infections may be DP5, making it a promising candidate for vaccine development.