Titre original :

Sensibilité de cellules cancéreuses au stress oxydatif : approche systémique pour étudier le couplage entre le métabolisme et le stress oxydatif

Titre traduit :

The sensitivity of cancer cells to oxidative stress : systemic approach to study the interplay between metabolic flux and oxidative stress

Mots-clés en français :
  • Voie des pentoses phosphates

  • Cellules
  • Stress oxydatif
  • Peroxyde d'hydrogène
  • Glucose
  • NAD (coenzyme)
  • Glutathion peroxydase
  • Dynamique moléculaire
  • Microscopie de fluorescence
  • Dispositifs fluidiques
  • Langue : Anglais
  • Discipline : Milieux dilués et optique fondamentale
  • Identifiant : 2020LILUR041
  • Type de thèse : Doctorat
  • Date de soutenance : 17/12/2020

Résumé en langue originale

Les cellules vivantes, lorsqu'elles sont constamment exposées au stress, sont capables de réagir de manière complexe en faisant intervenir divers réseaux de régulation intracellulaire. Leur régulation contrôle par exemple le devenir cellulaire en réponse à un stress oxydatif. Lorsque les mécanismes défensifs parviennent à faire face au stress, une rétroaction négative est impliquée et la cellule survit, sinon la cellule meurt. L'un des principaux mécanismes défensifs repose sur l'interaction entre le flux métabolique et le stress oxydatif, exploitant le rôle dualiste du peroxyde d'hydrogène, agissant à la fois comme une molécule de signalisation et de dommages. Nos travaux visent à identifier les molécules clés impliquées dans le devenir cellulaire et à suivre leur dynamique au niveau de la cellule unique, à l'aide de la microscopie de fluorescense. Dans un premier temps, nous concevons un système expérimental inspiré des études de chimiotaxie pour contrôler en permanence la dose appliquée de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à la lignée cellulaire du cancer du sein (MCF7). Le choix de la méthode de stimulation joue un rôle important dans notre étude. En effet, afin de délivrer une concentration constante de stimulus aux cellules de mammifères, un milieu de culture cellulaire H2O2 non réactif avec H2O2 est choisi. En utilisant un système fluidique, le taux de production intracellulaire de H2O2 est contrôlé en faisant varier la concentration externe de H2O2. La délivrance et l'élimination du stimulus sont ainsi effectuées assez rapidement (plus rapidement que la consommation cellulaire) pour étudier les réponses cellulaires dynamiques. Lors d'une stimulation constante, une dynamique d'adaptation est observée, ce qui suggère que des rétroactions négatives sont impliquées dans la protection cellulaire contre le stress. La variabilité d'une cellule à l'autre est observée et quantifiée à l'aide de paramètres d'adaptation identifiés. Des résultats préliminaires de la dépendance de la modulation du pH par l'état métabolique cellulaire sont discutés. Les caractéristiques d'adaptation ne sont pas représentées lorsque les sources de carbone sont complètement éliminées du milieu externe. Ce résultat souligne le rôle du glucose dans le mécanisme de défense cellulaire. Un autre résultat important est celui de la dynamique de rétroaction qui dépend de la dose de H2O2 appliquée aux cellules: une stimulation plus forte implique une réponse plus forte. C'est un premier facteur limitant que nous avons identifié lors de la quantification de la réponse de mort cellulaire au stress H2O2. Les résultats de la réponse à la dose de mort cellulaire suggèrent que le destin de la cellule (survie ou mort) dépend également à la fois du contrôle du stimulus et de l'état métabolique cellulaire. Afin d'identifier les voies métaboliques impliquées dans la rétroaction négative induite par le stress oxydatif, des molécules clés régulant la voie Phosphate Pentose (PPP) sont modulées. Nous concluons que l'orchestration du réseau moléculaire est plus complexe et que le PPP n'est pas le seul réseau impliqué dans la défense cellulaire. Nous concluons que l'orchestration du réseau moléculaire est plus complexe et que PPP est le réseau principal mais pas le seul impliqué dans la défense cellulaire. Dans ce manuscrit, une conception expérimentale est présentée afin d'étudier les réponses d'adaptation au stress oxydatif observée en temps réel. Nos expériences confirment la cinétique d'adaptation rapide du NAD(P)H déjà observée dans la littérature. Nous identifions, pour la première fois, un deuxième mécanisme de régulation où le système de glutathion se rétablit en 30 min pendant la stimulation contrôlée par H2O2. Le métabolisme du glucose soutient la régénération de ce système antioxydant et le réseau PPP est ainsi identifié comme le principal retour négatif dans l'adaptation moléculaire observée ici.

Résumé traduit

Living cells, when constantly exposed to stress, are able to respond in a complex manner involving various intracellular regulation networks. Their regulation controls for instance the cellular fate outcome in response to an oxidative stress. When defensive mechanisms manage to cope against stress, a negative feedback is involved and cell survive, otherwise cell dies. One of a key defensive mechanism relies on the interplay between metabolic flux and oxidative stress exploiting the dualistic role of hydrogen peroxide, acting both as signalling and damaging molecule. Our work aims to identify key molecules involved in cellular fate and to monitor their dynamics at the single cell level, using fluorescent microscopy. In a first step, we design an experimental system inspired by chemotaxis studies to constantly control the dose applied to breast cancer cell line (MCF7). The choice of the stimulation method plays an important role in our study. Indeed, in order to deliver a constant concentration of stimulus to mammalian cells, non-consuming H2O2 cell culture medium is chosen. Using a fluidic system, the intracellular H2O2 production rate is controlled by varying the external H2O2 concentration. Stimulus delivery and removal is thus performed fast enough (faster than cellular consumption) to study the dynamical cellular responses. During constant stimulation, adaptation dynamics are notified, suggesting that negative feedbacks are involved in the cellular protection against stress. Cell-to-cell variability is observed and can be quantified using identified adaptation parameters. The fluorescent signal is processed and preliminary results of pH modulation dependence by the cellular metabolic state are discussed. The adaptation features are not depicted when the carbon sources are completely removed from external medium. This result underlines the role of glucose in the cellular defensive mechanism. Another important result is that the feedback dynamics is depending by the H2O2 dose applied to cells: stronger stimulation implies stronger response. It is a first limiting factor we identified while quantifying the cell death response to H2O2 stress. The results of cell death dose response are suggesting that the cell fate (survival or death) is also depending by both the control of the stimulus and the cellular metabolic state. In order to identify the metabolic pathways involved in the negative feedback induced by the oxidative stress, key molecules regulating the Phosphate Pentose Pathway (PPP) are modulated. We conclude that the orchestration of molecular network is more complex and PPP is the main but not the only network involved in the cellular defense. In this manuscript an experimental design is presented in order to study the adaptation responses to oxidative stress in real time. Our experiments are confirming the fast adaptation kinetics of NAD(P)H already observed in literature. We identify, for the first time, a second regulation mechanism where the glutathione system is restoring within 30 min during controlled H2O2 stimulation. The glucose metabolism is supporting the regeneration of this antioxidant system and PPP network is thus identified as the main negative feedback in the molecular adaptation here observed.

  • Directeur(s) de thèse : Courtade, Emmanuel
  • Laboratoire : Laboratoire de Physique des Lasers, Atomes et Molécules (PhLAM)
  • École doctorale : École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Villeneuve d'Ascq, Nord)

AUTEUR

  • Simiuc, Dana
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