• Langue : Anglais
• Discipline : Micro-nanosystèmes et capteurs
• Identifiant : 2020LILUI079
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 17/12/2020

Résumé en langue originale

Dans ce projet de thèse, nous avons évalué l’apport des nanoparticules d’alginate sur la multifonction des bactériocines, en particulier l’entérocine DD14 (EntDD14). Cette bactériocine à deux peptides sans séquence leader, appartenant donc à la calsse IIb, a été caractérisée pour son activité antibactérienne contre des germes pathogènes comme Clostridium perfringens. Les nanoparticules d’alginate (AlgNPs) que nous avons utilisé ont été produites par un broyage physique, en utilisant un broyeur à billes (Retsch PM100), sans traitement chimique. Une fois les AlgNPs préparées, la bactériocine (EntDD14) est incorporée par adsorption physique à leur surface. Des analyses permettant d’établir l’activité antibactérienne contre des souches pathogènes de C. perfringens, isolées de poulets atteints d’entérite nécrotique, ont ensuite été effectuées. Ainsi, la concentration inhibitrice minimale (CMI) de la formulation, résultant de l’adsorption de l’EntDD14 sur les AlgNPs, a été diminuée d’un facteur de 4, par rapport à celle obtenue avec EntDD14 seule. Il convient de noter que la formulation mise au point dans le cadre de cette thèse reste active dans les conditions physiologiques du tractus gastrique de l'homme et du poulet reconstituées in vitro. Par ailleurs, nous avons également montré que l’EntDD14 seule, ou fixée sur les AlgNPs, ne présente aucune cytotoxicité cellulaire sur les modèles de cellulles humaines apprtenant aux lignées Caco-2 et HT-29 après 24 heures de contact. Par la suite l’impact de l’EntDD14 seule et/ou adsorbée sur des AlgNPs, à des concentrations sub-inhibitrices, sur le niveau d'expression des gènes codant pour la synthèse des toxines (toxine α, -Like toxine, la protéine d'adhésion du collagène et la cytolysine activée par le thiol) ont été déterminées. Ainsi, les niveaux d’expression de ces gènes ont été considérablement dminués après traitement de la culture avec les formulations EntDD14/AlgNPs mais pas l’adjonction de la bactériocine seule. L’augmentation de l’activité de la bactériocine par les nanoparticules, la réduction de l’expression des gènes codant les toxines impliquées dans la NE et l’absence de cytotoxité cellulaire montrent ainsi la viabilité de ce type de formulation comme alternative thérapeutique dans le traitement de cette pathologie. Afin d’évaluer l’apport des nanoparticules d’alginate sur les capacités multifonctionnelles de l’EntDD14 nous avons étudié l’impact de cette molécule, seule ou adsorbée sur les AlgNPs (à 1xCMI et 4xCMI), sur la réponse inflammatoire des cellules Caco2. Nous avons ciblé particulièrement les interleukines IL-6 et IL-8, après induction de l’inflammation avec du lipopolysacharide (LPS) (50 µg / ml) provenant d’Escherichia coli. Ainsi nous avons pu observer une réduction drastique du niveau de sécrétion de l’IL-6, passant de 2,5 pg/ml à moins de 0,5 pg/ml. Concernant l'IL-8, l'effet des différents traitements est également clairement établi, avec une diminution du niveau de sécrétion de cette interleukine d'au moins deux à trois fois en comparaison avec le contrôle inflammé mais non traité. Nous avons également étudié l'activité antivirale de la bactériocine EntDD14 libre et fixée sur les AlgNPs. Nous avons évalué cette activité contre le virus de l’herpès (HSV-1), en utilisant comme modèle des cellules Vero, provenant de reins de singe vert d’Afrique, infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,07. Celles-ci ont été incubées ensuite en présence de différentes concentrations d'EntDD14 (7,5 à 150 µg/ml) et après 24 h d'incubation, une baisse significative du titre viral a été observée pour les concentrations les plus élevées (>30 µg/ml). Ainsi ces travaux ont permis de mettre en évidence la multifonctionnalité de l’entérocine DD14 ainsi que sa pertinence comme alternative ou complément aux traitements antibiotiques en association avec les nanoparticules dans le contexte de l’entérite nécrotique.

Résumé traduit

In this PhD project, we used alginate nanoparticles as carriers of a leaderless two-peptide bacteriocin, the enterocin14designed EntDD14. This bacteriocin, previously isolated from Enterococcus faecalis 14 strain, was characterized for its potent anti-bacterial activity against a set of Gram-positive bacteria. Nanoparticles used here were obtained from aliginate, which is considered as a safe and sustainable polymer, by a green method (ball mill). Afterwards, EntDD14 was adsorbed onto these alginate nanoparticles (AlgNPs) by a simple physical process. Then, anti-bacterial activity of this formulation was measured against pathogenic strains of Clostridium perfringens isolated from chicken died from necrotic enteritis (NE). As a matter of fact, the antibacterial activity registered for the formulation has increased based on the MIC values obtained, which were 4 times below that registered for EntDD14 alone. Importantly, the activity of this newly developed formulation was then assessed under conditions mimicking those occurring in the gastro-intestinal tract of human as well as those form chicken. The activity remained thereof remarkably stable. Moreover, the safety of bacteriocin alone and adsorbed on the AlgNPs was established by studying the cytotoxicity onCaco-2 and HT-29 human cell lines models after 24 hours of contact. Further studies on the effect of EntDD14 alone, or EntDD14 loaded on alginate nanoparticles used at a sub-inhibitory concentration, were conducted on Clostrdia strains. The expression of genes coding for toxins involved in the pathogenicity of this malevolent bacterium was determined by qPCR. The toxins targeted were α-toxin, enteritis toxin B-Like, collagen adhesion protein and thiol activated cytolysin. Remarkably, the expression of these genes was significantly down-regulated following the addition of EntDD14 loaded on nanoparticles, but not upon the addition of EntDD14 alone. Taken together these data showed that adsorption of EntDD14 on aliginate nanoparticles permitted to obtain a safe formulation, with enhanced activity against Clostridium perfringens and able to decrease the toxins genes expression involved in the pathogenicity.To gain more insights and reveal further function attributable to EntDD14, we carried out a study on the synthesis of inetrleukines, mainly IL-6 and IL-8. This study consisted to induce inflammatory reaction by challenging eukaryotic Caco-2 cells with LPS. After induction of inflammation on Caco2 cells with LPS (50 µg/ml) from E. coli (LC control), the IL-6 secretion has reached 2.5 pg/ml, and whas drastically reduced to around 0.5 pg/ml when treated with EntDD14 at 60 and 240 µg/ml. Regarding IL-8, the effect of the different treatments was clear with a decrease in the IL-8 secreted in all cases by at least two to three foldsin comparion to untreated inflamed control (138.85 pg/ml). In this study, the antiviral activity of EntDD14 alone or that of the formulation was also evaluated. Thus, Vero cells, isolated from African green monkey’s kidney, infected with herpes simplex virus (HSV-1) at a multiplicity of infection (MOI) of 0.07, were incubated with different concentrations of EntDD14 ranging from 7.5 to 150 µg/ml. After to 24 h of incubation, the EntDD14 showed a significant anti-HSV1 activity at higher concentrations (>30 µg/ml).In conclusion EntDD14 exhibits interesting multifunctional actvitites and showed good suitability as alternative or complement antibiotic treatments in association with nanoparticles in necrotic enteritis context.