• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Biologie moléculaire et cellulaire
• Identifiant : 2019LILUS112
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 19/12/2019

Résumé en langue originale

Le complexe Polycomb PRC2 permet le dépôt de la marque épigénétique répressive H3K27me3 par sa sous unité catalytique, EZH2. Selon les types de cancers, EZH2 est soit surexprimée (prostate) ou fait l’objet de mutations perte ou gain de fonction, ce qui aboutit à des niveaux aberrants d’H3K27me3. In vitro, un tetramère constitué du « coeur » de PRC2, EZH2, SUZ12, EED et RBBP4 est suffisant pour catalyser la triméthylation d’H3K27. Par contre, in vivo, plusieurs facteurs modulant l’activité enzymatique du complexe PRC2 ou participant à son recrutement et/ou à sa stabilisation au niveau des régions génomiques adéquates ont été identifiés. Parmi ceux-ci, se trouve la protéine PCL3/PHF19, l’une des trois orthologues humains avec PHF1 et PCL2 de l’unique protéine Polycomb-like (PCL) de Drosophile. Ces protéines partagent un domaine N-terminal structuré consistant en l’enchaînement d’un domaine TUDOR, de deux domaines PHD (Plant Homeo Domain) suivi d’un domaine de type «Winged-helix » impliqué dans la fixation à l’ADN. En outre, hPCL3 fixe la marque activatrice H3K36me3 via son domaine TUDOR grâce à une «cage aromatique» constituée par les Acides Aminés W50, Y56, F74 et Y80 et permet ainsi l’intrusion de PRC2 dans l’euchromatine, l’activation d’EZH2 et le dépôt d’H3K27me3. En raison des différents sites de polyadénylation et d’événements d’épissage alternatifs, le locus humain hPCL3 / PHF19 code pour deux isoformes : une protéine de longueur totale hPCL3L/ PHF19L (580 AA) et une courte isoforme, hPCL3S/PHF19S (207 AA) contenant uniquement le domaine TUDOR, le premier des deux domaines PHD, le PHD1 et une région C-terminale spécifique à hPCL3S. Le domaine PHD1 est faiblement conservé parmi les 3 orthologues humains et pourrait être associé à des fonctions spécifiques de chaque orthologue, comme la stabilisation de P53 dans le cas de PHF1.Des expériences de RT-qPCR sur une cohorte de 25 tumeurs prostatiques ont révélé que hPCL3S est surexprimée dans 75% des cas. De plus, hPCL3S est surexprimée dans les lignées hormono-insensibles DU145 et PC3 mais pas dans la lignée hormono-sensible LNCaP. Dans des tests de blessure sur tapis confluents de cellules «Wound Healing assays », nous avons montré que l’inactivation spécifique par siARN de hPCL3S ralentit la prolifération et la migration des cellules DU145 qui le surexpriment. Inversement, la transfection stable de hPCL3S dans des LNCaP accroit ces propriétés. Ces effets reposent en partie sur la surexpression de gènes connus pour être importants pour la prolifération et/ou la migration de cellules cancéreuses de la prostate telles que S100A16, PlexinA2 et Spondin1. La transfection stable d’un mutant ponctuel de hPCL3S, W50A, incapable de fixer H3K36me3 se traduit par une prolifération accrue des LNCaP comme dans le cas de hPCL3S-WT. Ceci suggère que cet effet ne dépend pas de la fixation à la marque épigénétique H3K36me3 du domaine TUDOR. Par contre, une mutation dans le domaine PHD1 abolit l’effet sur la croissance. Ce domaine PHD1 est un domaine d’interaction protéine-protéine qui est très divergent entre les 3 orthologues Polycomb-like, et pourrait donc avoir des fonctions différentes. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un rôle de hPCL3S dans la progression tumorale prostatique et suggèrent que hPCL3S soit une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans les cancers de la prostate résistant à la castration.

Résumé traduit

The Polycomb PRC2 complex allows the deposition of the repressive epigenetic mark H3K27me3 by its catalytic subunit, EZH2. According to the type of cancers, EZH2 either is overexpressed (prostate) or is subject to loss or gain of function mutations, which lead to aberrant levels of H3K27me3. In vitro, a tetramer consisting of the "core" PRC2 subunits, EZH2, SUZ12, EED and RBBP4 is sufficient to catalyze the trimethylation of H3K27. In vivo, several factors modulating the enzymatic activity of the PRC2 complex or participating in its recruitment and/or its stabilization at the promoters of target genes have been identified. Among them, the three human orthologs of the unique Polycomb-like protein (PCL) of Drosophila, PHF1, PCL2 and PCL3/PHF19 have recently gained much attention. These proteins share a structured N-terminal domain consisting of a TUDOR domain and two PHD domains (Plant Homeo Domain) followed by a "Winged-helix" domain involved in DNA binding. In addition, PHF1 and PHF19 bind H3K36me3 via their TUDOR domain through an "aromatic cage" and thus allow the intrusion of PRC2 into euchromatin, the activation of EZH2 and H3K27me3 deposition. Owing to different polyadenylation sites and alternative splicing events, the human hPCL3/PHF19 locus encodes two isoforms: a full-length protein, hPCL3L/PHF19L and a shorter isoform, hPCL3S/PHF19S, which contains only the domain TUDOR, PHD1-the first of two PHD- domains and a small specific C-terminal region. The PHD1 domain, which is very divergent between the three orthologues, could be associated with specific functions of each orthologue. For example, PHF1 is the only one capable of inducing cell quiescence by interacting with and stabilizing P53 through its PHD1 domain and independently of its TUDOR domain. Our RT-qPCR experiments on a cohort of 25 prostate tumors revealed that hPCL3S is overexpressed in 75% of the cases. In addition, hPCL3S is overexpressed in the DU145 and PC3 hormone-insensitive cell lines, but not in the hormone-sensitive LNCaP cell line. In Wound-healing and proliferation assays, we have shown that the specific siRNA inactivation of hPCL3S decreases the proliferation and migration of DU145 cells that over-express it. Conversely, the stable transfection of hPCL3S into LNCaP increases these properties. These effects partially relied on the up-regulation of genes known to be important for the proliferation and/or migration of prostate cancer cells such as S100A16, PlexinA2 and Spondin1. Stable transfection of a punctual mutant of hPCL3S, W50A, is unable to bind H3K36me3 and results in increased proliferation of LNCaP as in the case of hPCL3S-WT. suggesting that this effect is not dependent on the reading H3K36me3 by the TUDOR domain.By contrast, a mutation in the PHD1 domain abolishes the effect on growth. This PHD1 domain is a protein-protein interaction domain that is very divergent between the 3 Polycomb-like orthologs, and could therefore have different functions. These results allow us to highlight the role of hPCL3S in prostate tumor progression and suggest that hPCL3S is a potential new therapeutic target in castration-resistant prostate cancer.