• Langue : Français
• Discipline : Biochimie et biologie moléculaire
• Identifiant : 2018LILUS049
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 14/12/2018

Résumé en langue originale

Tau est une protéine neuronale intrinsèquement désordonnée. Sa principale fonction est de réguler la polymérisation de la tubuline et la formation des microtubules. La protéine Tau est d’autre part impliquée dans la maladie d’Alzheimer ainsi que dans d’autres maladies neurodégénératives communément appelées tauopathies. En conditions pathologiques, la protéine Tau est retrouvée sous forme agrégée en structures fibrillaires. Tau est le constituant majeur des filaments hélicoïdaux appariés retrouvés dans les dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones et qui sont associées à ces maladies.Diverses hypothèses ont été explorées pour comprendre la cause de l’agrégation de la protéine Tau telles que des mutations au sein du gène codant pour la protéine, des modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation ou l’acétylation, des facteurs de nucléation pouvant favoriser son agrégation, ou encore l’identification des régions intrinsèques pro-agrégantes de la protéine. Plus récemment des résultats ont montré que la protéine Tau sous forme agrégée était capable de se propager dans les différentes régions du cerveau par différents mécanismes de transfert inter-neuronal et pourrait adopter un comportement de type prion.Certaines approches immunothérapeutiques ont été proposées pour cibler la protéine Tau extracellulaire et intracellulaire et ainsi empêcher la formation des fibres pathologiques. Des études ont montré qu’il était possible, en utilisant des anticorps ciblant des épitopes spécifiques de Tau, de réduire la formation de fibres et d’améliorer les fonctions cognitives chez des modèles de souris développant une tauopathie.Dans ce contexte, notre but est de développer et caractériser des anticorps à domaine unique dirigés contre différentes formes de protéines Tau, afin de mieux comprendre les mécanismes liés à son agrégation et à sa propagation dans un contexte pathologique, mais également comme outils pour explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les anticorps à domaine unique, également appelés VHHs (pour « variable heavy chain of the heavy chain only antibody ») sont constitués d’un domaine unique qui correspond à la chaine variable lourde retrouvée dans les immunoglobulines G de type 2 et 3 de la famille des Camelidae. De par leur petite taille, les VHHs échappent à certaines contraintes et peuvent être plus facilement utilisés dans des expériences in vitro et in vivo. Ils ont également été décrits comme étant capable de passer au travers de la barrière hématoencéphalique. Enfin, ils sont produits de manière peu coûteuse en système bactérien et peuvent être modifiés de manière recombinante pour en adapter les propriétés biochimiques.Dans un premier temps, et en collaboration avec la société Hybrigenics services, des VHHs ciblant les différentes formes de Tau ont été obtenus par phage display à partir d’une banque naïve synthétique. Les épitopes ont été identifiés par résonance magnétique nucléaire et les paramètres d’affinité pour chaque interaction VHH-Tau ont été déterminés par résonance plasmonique de surface.Dans un deuxième temps, des premiers tests d’agrégation de la protéine Tau ont été réalisés, dans le but d’évaluer l’effet des VHHs sur cette agrégation au regard de leur épitope et de leur affinité. L’un des VHHs, appelé E4-1 et ciblant les régions pro-agrégantes de Tau, est capable d’inhiber son agrégation in vitro. Toujours en collaboration avec Hybrigenics, le VHH E4-1 a été optimisé pour permettre son expression intracellulaire. Un mutant appelé VHH Z70 a été obtenu. Ce mutant a la particularité d’inhiber de façon plus importante l’agrégation de Tau in vitro mais il est également capable d’empêcher l’agrégation intracellulaire de Tau dans un modèle cellulaire de nucléation [...]

Résumé traduit

Tau is a neuronal protein playing a fundamental role in regulation of tubulin polymerization and microtubule stability. Beyond its major physiological activity, Tau is also involved in a group of diseases called tauopathies, including Alzheimer disease (AD). It is the principal component of the paired helical filaments, the aggregated form of Tau which constitutes the intracellular neurofibrillary tangles in AD.Although the mechanisms leading to these pathological Tau species is not clearly understood, different molecular features have been identified as involved in the aggregation process including : specific mutations identified in frontotemporal dementia, post-translational modifications such as phosphorylation, acetylation and truncations and the identification of the regions that compose the nuclei of Tau aggregation. Moreover, recent results showed that pathological Tau could propagate by an intracellular transfer between neurons and adopt a prion like character.Tau immunotherapy seems to be an attractive strategy in tauopathies to bind to and to clear extracellular and/or intracellular pathological species of the Tau protein to slow disease progression. Indeed, by targeting different Tau epitopes immunotherapy studies showed a reduction of Tau pathology and cognitive deficit in different mouse models of tauopathy.In this context, our goal is to develop and characterize VHH targeted against Tau. VHH are also called single domain antibodies. They are constituted of an unique domain which corresponds to the variable heavy chain from the Immunoglobulin G from Camelidae. Due to their small size (15 kDa), VHH can be used in vitro and in vivo assays. They are produced as recombinant proteins and can easily be modified or optimized for these specific uses.To begin, in partnership with Hybrigenics services Company, we obtained VHHs against Tau from a synthetic library. The recognition site of these VHHs on Tau was determined using NMR chemical shift perturbation experiments using 2D spectra. Affinity parameters characterizing the interaction were evaluated using SPR.Then, we screened the characterized VHHs to test their ability to inhibit the aggregation of Tau in an in vitro assay. Some of these VHHs, such as E4-1 which target the aggregation region of Tau, have shown a strong inhibition effect on its aggregation in vitro. In collaboration with Hybrigenics services, we optimized the VHH E4-1 intro a new mutant Z70 that are actively expressed in cells. Interestingly, the optimized mutant Z70 displays better KD and better inhibition of the Tau aggregation in vitro than VHH E4-1. And expression of VHH Z70 in a cellular model of Tau seeding decreased its fluorescence-reported aggregation.Finally, we started preliminary studies in a mouse model of tauopathy. Intracranial injections of VHH E4-1 into the mice hippocampus lead to its diffuse localization in the hippocampus and its internalization into the cortex neurons, suggesting that the internalization is maybe specific to these neurons. Intraperitoneal injections showed that E4-1 is not localized in the mice brain and doesn’t seem to be able to cross the blood brain barrier. We then decided to adopt a novel strategy to study the therapeutic potential of the VHH Z70.