• Langue : Français
• Discipline : Biotechnologies
• Identifiant : 2015LIL2S072
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 18/12/2015

Résumé en langue originale

A ce jour l’os est le tissu le plus greffé au monde et les défets osseux suite à une ostéoporose, cancer et fractures restent problématiques avec un risque d’infections élevé. L’administration d’antibiotiques par voie systémique n'est pas satisfaisante car leur diffusion dans l'os est très faible, une administration locale est donc nécessaire. La stratégie de cette thèse est de développer deux substituts hybrides (hydroxyapatite/hydrogel), l'un massif, l'autre injectable, pour l'administration d'une association d'antibiotiques (ciprofloxacine/gentamicine). Un double système à libération sera ainsi développé pour traiter au long terme l'infection, l'un permettra une libération rapide (via la diffusion dans l'hydrogel), l'autre permettra une diffusion lente (via des microparticules). La première partie a permis de développer des microparticules de PLGA chargées de gentamicine (GM) par la technique de double émulsion par évaporation du solvant. La méthode de préparation des microparticules a été optimisée pour obtenir des microparticules de 50 à 80 µm, compatible avec la macroporosité de l'hydroxyapatite (HA) et une libération prolongée pendant 25-30 jours. Ainsi le temps de sonification de la première émulsion a été fixé à 2 minutes pour obtenir une efficacité d'encapsulation maximale et la vitesse de rotation de la seconde émulsion fixée à 700 rpm pour obtenir des microparticules d'environ 60 µm. Les microparticules ont été analysées par DSC, ATG et MEB. L'activité antibactérienne des microparticules chargées de GM a été démontrée sur le S. aureus (CIP224).La seconde partie a permis de développer un scaffold où l'hydrogel de chitosan (CHT) se formera in situ dans la macroporosité d'une pièce tridmensionnelle en HA. Cet hydrogel a été obtenu par voie chimique avec un agent réticulant (genipine) pour permettre une injection et une gélification relativement lente. Le suivi de la formation de l'hydrogel de CHT (2%-wt) par spectrophotométrie et rhéologie a permis d'optimiser le temps (24 heures) et la température (40°C) de gélification ainsi que la concentration de génipine (0.05%-wt). L'étude de la cinétique de libération de la ciprofloxacine (CFX) incorporée dans l'hydrogel lors de la formulation (0.1; 0.5 et 1%) a montré une libération rapide (<5 heures) en flux dynamique (30 ml/min). L'ajout de cyclodextrine(CD) dans la formulation pour ralentir la diffusion de la CFX n'a pas montré d'amélioration, elle est même responsable d'un ralentissement de la gélification par inclusion de la génipine dans la CD. Finalement l'hydrogel a été incorporé dans la macroporosité de l'HA avant la gélification; les études biologiques ont montré sa cytocompatibilité et une activité antibactérienne de 24 heures sur E. coli.La dernière partie a permis de développer un hydrogel injectable où les particules d'HA (90 µm) ont été incorporées dans l'hydrogel pendant la préparation. Cet hydrogel est obtenu par voie physique avec le polymère de cyclodextrine (PCD) pour une gélification rapide (<10 sec.) évitant la sédimentation de l'HA. Une étude plus approfondie a permis de montrer qu'une proportion d’au moins de 3% de CHT et d’au moins 3% de PCD était nécessaire pour la formation de l'hydrogel. Les études du gonflement et des propriétés rhéologiques ont montré l’impact du ratio PCD/CHT, de la forme soluble et insoluble du PCD et l'ajout d'HA sur la formation de l'hydrogel. Après lyophilisation, l'éponge a été hydratée dans une solution de CFX (2 mg/ml); les études biologiques n'ont pas montré de cytotoxicité et l'évaluation microbiologique a montré une activité prolongée (72 heures) sur E. coli [...].

Résumé traduit

Bone is the most transplanted tissue in the world and bone defects after osteoporosis, cancer and fractures remain problematic with a high level of infections. Systemic drug delivery is not efficient due to a low migration of drug into the bone, a local administration is necessary. The strategy of this thesis is to develop two hybrid substitutes (hydroxyapatite / hydrogel), the first one could be injectable and the other one could be directly implanted for the release of a combination of antibiotics (ciprofloxacin / gentamicin). A dual release system will be developed to treat long term infection with a rapid release (via diffusion into the hydrogel) and a slow release (via microparticles).In the first part, gentamicin (GM)-loaded PLGA microparticles were prepared by double emulsion with evaporation of the solvent. The microparticle preparation method has been optimized to obtain a size of microparticles compatible with the macroporosity of the hydroxyapatite (HA) and a sustained release over 25-30 days. Thus, the time of sonification of the first emulsion was set at 2 minutes in order to obtain a maximal efficacy of encapsulation. The speed of rotation of the second emulsion was fixed at 700 rpm to obtain a 60µm-diameter size of microparticles. The microparticles were analyzed by DSC, TGA and SEM. The antibacterial activity of gentamicin loaded microparticles was demonstrated on S. aureus (CIP224).In the second part we developed a bone substitute where chitosan (CHT) hydrogel was formed in situ in the macroporosity of a tridimensional hydroxyapatite printed piece. This hydrogel was obtained chemically with a crosslinking agent (genipin) to allow injection and a relatively slow gelation. The formation of the CHT hydrogel (2%-wt) was analyzed by UV-Vis spectrophotometry and rheology to optimize the time (24 hours), the temperature (40°C) and the concentration of genipin (0.05%-wt). The study of the release kinetics of ciprofloxacin (CFX) incorporated into the hydrogel (0.1; 0.5 and 1%) showed rapid release (<5 hours) in dynamic system (30 ml/min). The addition of cyclodextrin (CD) in the formulation did not shown a prolonged release of CFX, itself responsible to an increase of the gelation time due to an inclusion of genipin in the CD. Finally the hydrogel was incorporated in the macroporosity of HA before the gelation. Biological evaluation showed its cytocompatibility and antibacterial activity up to 24 hours on E. coli._x000D_In the last part, we developed an injectable bone substitute where HA particles (90 microns) were incorporated into the hydrogel during the preparation. This hydrogel was obtained by a physical way with an anionic polymer of cyclodextrin (PCD) for a fast gelation time (<10 seconds) avoiding sedimentation of the HA. Further study showed that a proportion of at least 3% of CHT and at least 3% of PCD was required for the formation of the hydrogel. Swelling and rheological properties showed the impact of the ratio PCD / CHT, the soluble and insoluble form of the PCD and the addition of HA on the formation of the hydrogel. After lyophilization, the sponge was hydrated in a solution of CFX (2 mg/ml). Biological studies did not shown cytotoxicity and microbiological evaluation showed a prolonged antibacterial activity up to 72 hours on E. coli.In conclusion, this thesis allowed the development of two hybrid bone substitutes for rapid release of CFX (<72 hours) and slow release of gentamicin-loaded microparticles (25-30 days). The incorporation of gentamicin loaded microparticles was possible in both bone substitutes allowing an antibacterial activity until 3 days against S. aureus and E. coli.