Note ABES Development and validation of kinase activity reporters for the dynamical study of cell response modalities by microscopy : Role of the Mitogen-Activated Protein Kinase / Extracellular signal-Regulated Kinase in necroptosis Développement et validation de rapporteurs d'activité kinase pour l'étude dynamique des processus cellulaires par microscopie : rôle de la Mitogen-Activated Protein Kinase / Extracellular signal-Regulated Kinase dans la nécroptose Nécroptose 571.939 MAP kinase Protéines kinases Mort cellulaire TNF-alpha Sondes fluorescentes Dynamique moléculaire Transduction du signal cellulaire Microscopie de fluorescence La nécroptose est une mort programmée caspase indépendante, induite par le Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) et fait intervenir une voie de signalisation impliquant deux kinases, les Receptor-Interacting Protein Kinases 1 et 3 (RIPK1 et RIPK3) et la pseudo-kinase Mixed Lineage Kinase domain-Like protein (MLKL). L’activation des kinases Extracellular signal-Regulated Kinase 1 et 2 (ERK1/2) a été rapportée dans plusieurs morts cellulaires programmées. Par ailleurs, la régulation de l’activité de ERK1/2 en termes d’amplitude, de durée et de localisation via des régulateurs spatio-temporels spécifiques est nécessaire pour l’orientation du destin cellulaire. L’inhibition de ERK1/2 retarde la nécroptose induite par le TNFα dans les L929 de manière dose-dépendante, sans pour autant la bloquer, suggérant un rôle pro-nécrotique de ERK1/2. Dans ces conditions expérimentales, une activité biphasique et compartimentée de ERK1/2 a été observée. De plus, nos résultats indiquent que la phosphorylation ERK1/2 est RIPK1 dépendante. Nous avons développé un nouveau rapporteur de localisation de ERK2, appelé ERK2-LOC. Une translocation transitoire suivi d’une accumulation nucléaire de ERK2 suite à la stimulation des L929 par le TNFα a été observée. Les mesures d’activité de ERK1/2 au cours de la nécroptose ont été réalisées avec un biosenseur FRET d’activité kinase (ERK1/2-ACT). Son utilisation a révélé une signature spatio-temporelle spécifique d’activité au cours de la nécroptose. Afin de corréler les signatures d’activité de ERK1/2 avec celles des kinases RIPK1 et RIPK3, nous avons développé une première génération de biosenseurs FRET pour ces kinases initiatrices de la nécroptose. Necroptosis is defined as a caspase-independent programmed cell death and relies on a signaling pathway involving two serine-threonine kinases: Receptor-Interacting Protein Kinase 1 and 3 (RIPK1 and RIPK3) and the pseudo-kinase Mixed-Lineage Kinase Like (MLKL). Activation of Extracellular signal-Regulated Kinases 1 and 2 (ERK1/2) was reported to be involved in different modes of programmed cell death. It is now accepted that the regulation of the duration, magnitude and subcellular compartmentalization of ERK1/2 activity by specific spatio-temporal regulators is interpreted by the cell towards cell fate determination. ERK1/2 inhibition delays TNFα-induced necroptosis in L929 cells in a dose dependent manner but did not block it, providing arguments for a pro-necrotic function of ERK1/2. In this context, a compartmentalized biphasic phosphorylation of ERK1/2 was observed. Our results indicate a RIPK1-dependent phosphorylation of ERK1/2. Owing to the importance of ERK1/2 spatio-temporal dynamics in determining cellular responses, we developed a new reporter of ERK2 localization named ERK2-LOC. We observed a transient translocation of ERK2 when necroptosis was triggered in L929 upon TNFα stimulation, followed by progressive ERK2 accumulation in the nucleus. ERK1/2 activities were monitored during necroptosis using a FRET-based kinase biosensor for ERK1/2 (ERK1/2-ACT). Using ERK1/2-ACT, a dedicated spatio-temporal signature of ERK1/2 activity was recorded during necroptosis. Finally, to correlate ERK1/2 activity code with necroptosis occurrence, we also engineered a first generation of FRET biosensors to report on both RIPK1 and RIPK3 activities during necroptosis. Electronic Thesis or Dissertation Text en fr PDF 13139073 text/html https://pepite-depot.univ-lille.fr/ToutIDP/EDBSL/2015/50376-2015-Sipieter.pdf Sipieter François Sipieter 1986-10-07 FR 192590766 https://theses.fr/2015LIL10167 2015LIL10167 https://doi.org/10.70675/d530ded3z94aez4864z858azb556e4d75412 2015-12-03 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Lille 1 026404184 Universiteit Gent (1817-....) MADS_ETABLISSEMENT_DE_COTUTELLE_1 026420023 Doctorat Docteur es non oui Cailliau Katia MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 125305702 Vandenabeele Peter MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_2 132511770 Riquet Franck MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_3 172175283 Héliot Laurent MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_4 188225412 École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 147705126 Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle (Villeneuve d'Ascq ; 1998-....) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 134442571 Laboratoire de Physique des Lasers, Atomes et Molécules (PhLAM) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_2 161618847 ddc:570 Rijksuniversiteit te Gent Cailliau Katia Vandenabeele Peter Riquet Franck Héliot Laurent École doctorale Biologie-Santé (Lille) Unité de glycobiologie structurale et fondamentale (UGSF) Laboratoire de physique des lasers, atomes et molécules (PhLAM) PDF 13139073