• Langue : Français, Anglais
• Discipline : Biologie-Santé
• Identifiant : 2008LIL10008
• Type de thèse : Doctorat
• Date de soutenance : 21/03/2008

Résumé en langue originale

L'ingénierie génétique des plastes est une technologie émergente considérée tant pour l'amélioration de certains caractères d'intérêt agronomiques, que pour la production de biomatériaux et de protéines thérapeutiques. Dans la première partie de nos travaux, nous nous sommes intéressés au potentiel de ces organites, d'origine procaryotique, à replier correctement et accumuler une enzyme contenant des ponts disulfures. Nous avons montré qu'à l'inverse du cytoplasme bactérien, le stroma des chloroplastes de tabac permet la formation d'une phosphatase alcaline recombinante dont l'activité et la stabilité dépendent de la présence de ses deux ponts disulfures intramoléculaires. L'adressage de cette enzyme au Iumen des thylacoides via le système Sec résulte en un niveau d'expression plus élevé et une plus grande activité spécifique de la protéine. Des approches complémentaires ont été initiées dans le tabac, avec des protéines chaperonnes impliquées dans la formation des ponts disulfures, et d'une protéine fluorescente verte (GFP) sensible aux variations redox. Ces résultats nous informent sur les propriétés de repliement au sein des chloroplastes et ont des implications biotechnologiques importantes pour la production de nombreuses protéines thérapeutiques dans les plantes. Les chloroplastes recombinants ont la capacité d'accumuler une quantité massive de protéines recombinantes. Pour la seconde partie de nos travaux, nous nous sommes attardés sur les conséquences d'un niveau d'expression extrême. Nous avons analysé les plastes transformés de tabac accumulant la pbosphatase alcaline, une GFP, ainsi qu'une hydroxyphényl pyruvate dioxygénase bactérienne. Ces lignées ont une croissance normale et aucune perturbation significative du transcriptome n'a été observée. En revanche, l'analyse du protéome des feuilles a révélé des différences et en particulier une diminution drastique de l'accumulation de la Rubisco. L'impact de l'accumnlation massive de la protéine recombinante sur le métabolisme de la plante est discuté.

Résumé traduit

Plastid genome engineering is an emerging technology which is being considered for the improvement of plant agronomic traits as well as for the molecular farming of biomaterials and therapeutic proteins. In the first part of this work, the potential of these organelles of prokaryotic origin to correctly fold and accumulate a disulfide bond containing enzyme has been investigated. Unlike a normal bacterial cytosol, the stroma of tobacco chloroplasts was found to support the formation of a recombinant alkaline phosphatase from Escherichia coli, whose activity and stability depend on the presence of two intra-molecular disulfide bonds. Targeting this enzyme to the thylakoid lumen via the Sec pathway resulted in stronger accumulation levels and higher specific activity. Complementary approaches have been initiated in tobacco using bacterial chaperones involved in the catalysis of disulfide bond formation, and a redox sensitive green fluorescent protein. These findings shed some light on the folding properties within chloroplasts, and have important biotechnological implications for the production in plants of many therapeutic proteins. Recombinant chloroplasts have the capacity to accumulate massive amounts of recombinant protein. The second part of this work focused on the consequences on the plant fitness and physiology of such extreme expression levels. We have analyzed tobacco plastid transformants accumulating alkaline phosphatase, a green fluorescent protein, and a bacterial hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase. These lines exhibited a normal wild-type growth rate, and no significant perturbation of the chloroplast transcriptome was observed. In contrast, a proteomic approach on leaves revealed some differences, in particular a massive drop in the amount of Rubisco. The impact of recombinant protein expression on plant metabolism is discussed.